The human genome contains many thousands of long noncoding RNAs (lncRNAs). While several studies have demonstrated compelling biological and disease roles for individual examples, analytical and experimental approaches to investigate these genes have been hampered by the lack of comprehensive lncRNA annotation. Here, we present and analyze the most complete human lncRNA annotation to date, produced by the GENCODE consortium within the framework of the ENCODE project and comprising 9277 manually annotated genes producing 14,880 transcripts. Our analyses indicate that lncRNAs are generated through pathways similar to that of protein-coding genes, with similar histone-modification profiles, splicing signals, and exon/intron lengths. In contrast to protein-coding genes, however, lncRNAs display a striking bias toward two-exon transcripts, they are predominantly localized in the chromatin and nucleus, and a fraction appear to be preferentially processed into small RNAs. They are under stronger selective pressure than neutrally evolving sequences—particularly in their promoter regions, which display levels of selection comparable to protein-coding genes. Importantly, about one-third seem to have arisen within the primate lineage. Comprehensive analysis of their expression in multiple human organs and brain regions shows that lncRNAs are generally lower expressed than protein-coding genes, and display more tissue-specific expression patterns, with a large fraction of tissue-specific lncRNAs expressed in the brain. Expression correlation analysis indicates that lncRNAs show particularly striking positive correlation with the expression of antisense coding genes. This GENCODE annotation represents a valuable resource for future studies of lncRNAs.

While the long noncoding RNAs (ncRNAs) constitute a large portion of the mammalian transcriptome, their biological functions has remained elusive. A few long ncRNAs that have been studied in any detail silence gene expression in processes such as X-inactivation and imprinting. We used a GENCODE annotation of the human genome to characterize over a thousand long ncRNAs that are expressed in multiple cell lines. Unexpectedly, we found an enhancer-like function for a set of these long ncRNAs in human cell lines. Depletion of a number of ncRNAs led to decreased expression of their neighboring protein-coding genes, including the master regulator of hematopoiesis, SCL (also called TAL1), Snai1 and Snai2. Using heterologous transcription assays we demonstrated a requirement for the ncRNAs in activation of gene expression. These results reveal an unanticipated role for a class of long ncRNAs in activation of critical regulators of development and differentiation.PaperClip/cms/asset/f93cfb14-e7bb-4cde-8449-61bcd325a810/mmc7.mp3Loading ...(mp3, 3.67 MB) Download audio

The laboratory mouse shares the majority of its protein-coding genes with humans, making it the premier model organism in biomedical research, yet the two mammals differ in significant ways. To gain greater insights into both shared and species-specific transcriptional and cellular regulatory programs in the mouse, the Mouse ENCODE Consortium has mapped transcription, DNase I hypersensitivity, transcription factor binding, chromatin modifications and replication domains throughout the mouse genome in diverse cell and tissue types. By comparing with the human genome, we not only confirm substantial conservation in the newly annotated potential functional sequences, but also find a large degree of divergence of sequences involved in transcriptional regulation, chromatin state and higher order chromatin organization. Our results illuminate the wide range of evolutionary forces acting on genes and their regulatory regions, and provide a general resource for research into mammalian biology and mechanisms of human diseases.

Long noncoding RNAs (lncRNAs) are emerging as important regulators of developmental pathways. However, their roles in human cardiac precursor cell (CPC) remain unexplored. To characterize the long noncoding transcriptome during human CPC cardiac differentiation, we profiled the lncRNA transcriptome in CPCs isolated from the human fetal heart and identified 570 lncRNAs that were modulated during cardiac differentiation. Many of these were associated with active cardiac enhancer and super enhancers (SE) with their expression being correlated with proximal cardiac genes. One of the most upregulated lncRNAs was a SE-associated lncRNA that was named CARMEN, (CAR)diac (M)esoderm (E)nhancer-associated (N)oncoding RNA. CARMEN exhibits RNA-dependent enhancing activity and is upstream of the cardiac mesoderm-specifying gene regulatory network. Interestingly, CARMEN interacts with SUZ12 and EZH2, two components of the polycomb repressive complex 2 (PRC2). We demonstrate that CARMEN knockdown inhibits cardiac specification and differentiation in cardiac precursor cells independently of MIR-143 and -145 expression, two microRNAs located proximal to the enhancer sequences. Importantly, CARMEN expression was activated during pathological remodeling in the mouse and human hearts, and was necessary for maintaining cardiac identity in differentiated cardiomyocytes. This study demonstrates therefore that CARMEN is a crucial regulator of cardiac cell differentiation and homeostasis.

Abstract How genome instability is harnessed for fitness gain despite its potential deleterious effects is largely elusive. An ideal system to address this important open question is provided by the protozoan pathogen Leishmania , which exploits frequent variations in chromosome and gene copy number to regulate expression levels. Using ecological genomics and experimental evolution approaches we provide first evidence that Leishmania adaptation relies on epistatic interactions between functionally associated gene copy number variations in pathways driving fitness gain in a given environment. We further uncover post-transcriptional regulation as a key mechanism that compensates for deleterious gene dosage effects and provides phenotypic robustness to genetically heterogenous parasite populations. Finally, we correlate dynamic variations in snoRNA gene dosage with changes in rRNA 2’- O -methylation and pseudouridylation, suggesting translational control is an additional layer of parasite adaptation. Leishmania genome instability is thus harnessed for fitness gain by genome-dependent variations in gene expression, and genome-independent, compensatory mechanisms. This allows for polyclonal adaptation and maintenance of genetic heterogeneity despite strong selective pressure. The epistatic adaptation described here needs to be considered in Leishmania epidemiology and biomarker discovery, and may be relevant to other fast evolving, eukaryotic cells that exploit genome instability for adaptation, such as fungal pathogens or cancer. One Sentence Summary Epistatic interactions harness genome instability for Leishmania fitness gain.

Abstract The protozoan parasite Leishmania donovani causes fatal human visceral leishmaniasis in absence of treatment. Genome instability has been recognized as a driver in Leishmania fitness gain in response to environmental change or chemotherapy. How genome instability generates beneficial phenotypes despite potential deleterious gene dosage effects is unknown. Here we address this important open question applying experimental evolution and integrative systems approaches on parasites adapting to in vitro culture. Phenotypic analyses of parasites from early and late stages of culture adaptation revealed an important fitness tradeoff, with selection for accelerated growth in promastigote culture (fitness gain) impairing infectivity (fitness costs). Comparative genomics, transcriptomics and proteomics analyses revealed a complex regulatory network driving parasite fitness, with genome instability causing highly reproducible, gene dosage-dependent changes in protein abundance linked to post-transcriptional regulation. These in turn were associated with a gene dosage-independent reduction in abundance of flagellar transcripts and a coordinated increase in abundance of coding and non-coding RNAs implicated in ribosomal biogenesis and protein translation. We correlated differential expression of small nucleolar RNAs (snoRNAs) with changes in rRNA modification, providing first evidence that Leishmania fitness gain in culture may be controlled by post-transcriptional and epitranscriptomic regulation. Our findings propose a novel model for Leishmania fitness gain in culture, where differential regulation of mRNA stability and the generation of fitness-adapted ribosomes may potentially filter deleterious from beneficial gene dosage effects and provide proteomic robustness to genetically heterogenous, adapting parasite populations. This model challenges the current, genome-centric approach to Leishmania epidemiology and identifies the Leishmania transcriptome and non-coding small RNome as potential novel sources for the discovery of biomarkers that may be associated with parasite phenotypic adaptation in clinical settings.

Abstract Development of cervical cancer is directly associated with integration of human papillomavirus (HPV) genomes into host chromosomes and subsequent modulation of HPV oncogene expression, which correlates with multi-layered epigenetic changes at the integrated HPV genomes. However, the process of integration itself and dysregulation of host gene expression at sites of integration in our model of HPV16 integrant clone natural selection has remained enigmatic. We now show, using a state-of-the-art ‘HPV integrated site capture’ (HISC) technique, that integration likely occurs through microhomology-mediated repair (MHMR) mechanisms via either a direct process, resulting in host sequence deletion (in our case, partially homozygously) or via a ‘looping’ mechanism by which flanking host regions become amplified. Furthermore, using our ‘HPV16-specific Region Capture Hi-C’ technique, we have determined that three-dimensional (3D) interactions between the integrated virus genome and host chromosomes, both at short- (<500 kbp) and long-range (>500 kbp), appear to drive host gene dysregulation through the disruption of local host:host 3D interactions known as topologically associating domains (TADs). This mechanism of HPV-induced host gene expression modulation indicates that integration of virus genomes near to or within a ‘cancer-causing gene’ is not essential to influence such genes within an entire TAD and that these modifications to 3D interactions could have a major role in selection of HPV integrants at the early stage of cervical neoplastic progression.

Abstract Genome instability has been recognized as a key driver for microbial and cancer adaptation and thus plays a central role in many human pathologies. Even though genome instability encompasses different types of genomic alterations, most available genome analysis software are limited to just one kind mutation or analytical step. To overcome this limitation and better understand the role of genetic changes in enhancing pathogenicity we established GIP, a novel, powerful bioinformatic pipeline for comparative genome analysis. Here we show its application to whole genome sequencing datasets of Leishmania , Plasmodium, Candida , and cancer. Applying GIP on available data sets validated our pipeline and demonstrated the power of our analysis tool to drive biological discovery. Applied to Plasmodium vivax genomes, our pipeline allowed us to uncover the convergent amplification of erythrocyte binding proteins and to identify a nullisomic strain. Re-analyzing genomes of drug adapted Candida albicans strains revealed correlated copy number variations of functionally related genes, strongly supporting a mechanism of epistatic adaptation through interacting gene-dosage changes. Our results illustrate how GIP can be used for the identification of aneuploidy, gene copy number variations, changes in nucleic acid sequences, and chromosomal rearrangements. Altogether, GIP can shed light on the genetic bases of cell adaptation and drive disease biomarker discovery. One Sentence Summary GIP - a novel pipeline for detecting, comparing and visualizing genome instability.

Abstract Pathogenic Leptospira are the causative agents of leptospirosis, the most widespread zoonotic infectious disease. Leptospirosis is a potentially severe and life-threatening emerging disease with highest burden in sub-tropical areas and impoverished populations. Mechanisms allowing pathogenic Leptospira to survive inside a host and induce acute leptospirosis are not fully understood. The ability to resist deadly oxidants produced by the host during infection is pivotal for Leptospira virulence. We have previously shown that genes encoding defenses against oxidants in L. interrogans are repressed by PerRA (encoded by LIMLP_10155), a peroxide stress regulator of the Fur family. In this study, we describe the identification and characterization of another putative PerR-like regulator (LIMLP_05620) in L. interrogans . Protein sequence and phylogenetic analyses indicated that LIMLP_05620 displayed all the canonical PerR amino acid residues and is restricted to pathogenic Leptospira clades. We therefore named this PerR-like regulator PerRB. In L. interrogans , the PerRB regulon is distinct from that of PerRA. While a perRA mutant had a greater tolerance to peroxide, inactivating perRB led to a higher tolerance to superoxide, suggesting that these two regulators have a distinct function in the adaptation of L. interrogans to oxidative stress. The concomitant inactivation of perRA and perRB resulted in a higher tolerance to both peroxide and superoxide and, unlike the single mutants, a double perRAperRB mutant was avirulent. Interestingly, this correlated with major changes in gene and non-coding RNA expression. Notably, several virulence-associated genes ( clpB , ligA/B , and lvrAB ) were repressed. By obtaining a double mutant in a pathogenic Leptospira strain, our study has uncovered an interplay of two PerRs in the adaptation of Leptospira to oxidative stress with a putative role in virulence and pathogenicity, most likely through the transcriptional control of a complex regulatory network. Author summary Leptospirosis is a widespread infectious disease responsible for over one million of severe cases and 60 000 fatalities annually worldwide. This neglected and emerging disease has a worldwide distribution, but it mostly affects populations from developing countries in sub-tropical areas. The causative agents of leptospirosis are pathogenic bacterial Leptospira spp. There is a considerable deficit in our knowledge of these atypical bacteria, including their virulence mechanisms. In addition to the Leptospira PerRA regulator that represses defenses against peroxide, we have identified and characterized a second PerR regulator in pathogenic Leptospira species (PerRB) that participates in Leptospira tolerance to superoxide. Phenotypic and transcriptomic analyses of single PerRA and PerRB mutants suggest that the two PerRs fulfill distinct functions in the adaptation to oxidative stress. Concomitant inactivation of PerRA and PerRB resulted in a higher tolerance to both peroxide and superoxide. Moreover, the perRAperRB mutant lost its virulence. Major changes in gene expression, including a decreased expression of several virulence factors, were observed in the double perRAperRB mutant. Our study suggests that PerRA and PerRB cooperate to orchestrate a complex regulatory network involved in Leptospira virulence.

Aberrant macrophage activation during intracellular infection generates important immunopathologies that can cause severe human morbidity. A better understanding of microbial immune subversion strategies and macrophage phenotypic and functional responses is a prerequisite for the design of novel, host-directed intervention strategies. Here, we uncover a fine-tuned transcriptional response induced in primary macrophages infected by the human parasite Leishmania amazonensis that prevents NF-kB and NLRP3 inflammasome activation. This unusual subversion is characterized by respectively suppression and induction of activating and de-activating components of the NF-kB and NLRP3 pathways. This dichotomic modulation was associated with histone H3 hypoacetylation at promoters of NF-kB-related, pro-inflammatory genes. Our results reveal a novel Leishmania immune subversion strategy targeting host cell epigenetic regulation to modulate the macrophage phenotype. Modulation of the macrophage epigenetic landscape establishes conditions beneficial for intracellular parasite survival, and opens interesting new venues for host-directed, anti-microbial drug discovery.