A number of vital biological processes rely on fast and precise recognition of a specific DNA sequence (site) by a protein. How can a protein find its site on a long DNA molecule among 106–109 decoy sites? Here, we present our recent studies of the protein–DNA search problem. Seminal biophysical works suggested that the protein–DNA search is facilitated by 1D diffusion of the protein along DNA (sliding). We present a simple framework to calculate the mean search time and focus on several new aspects of the process such as the roles of DNA sequence and protein conformational flexibility. We demonstrate that coupling of DNA recognition with conformational transition within the protein–DNA complex is essential for fast search. To approach the complexity of the in vivo environment, we examine how the search can proceed at realistic DNA concentrations and binding constants. We propose a new mechanism for local distance-dependent search that is likely essential in bacteria. Simulations of the search on tightly packed DNA and crowded DNA demonstrate that our theoretical framework can be extended to correctly predicts search time in such complicated environments. We relate our findings to a broad range of experiments and summarize the results of our recent single-molecule studies of a eukaryotic protein (p53) sliding along DNA.

Abstract Proper development depends on precise spatiotemporal gene expression patterns. Most genes are regulated by multiple enhancers and often by multiple core promoters that generate similar transcripts. We hypothesize that these multiple promoters may be required either because enhancers prefer a specific promoter or because multiple promoters serve as a redundancy mechanism. To test these hypotheses, we studied the expression of the knirps locus in the early Drosophila melanogaster embryo, which is mediated by multiple enhancers and core promoters. We found that one of these promoters resembles a typical “sharp” developmental promoter, while the other resembles a “broad” promoter usually associated with housekeeping genes. Using synthetic reporter constructs, we found that some, but not all, enhancers in the locus show a preference for one promoter. By analyzing the dynamics of these reporters, we identified specific burst properties during the transcription process, namely burst size and frequency, that are most strongly tuned by the specific combination of promoter and enhancer. Using locus-sized reporters, we discovered that even enhancers that show no promoter preference in a synthetic setting have a preference in the locus context. Our results suggest that the presence of multiple promoters in a locus is both due to enhancer preference and a need for redundancy and that “broad” promoters with dispersed transcription start sites are common among developmental genes. Our results also imply that it can be difficult to extrapolate expression measurements from synthetic reporters to the locus context, where many variables shape a gene’s overall expression pattern.

Abstract Most multicellular organisms, including fruit flies, possess an innate immune response, but lack an adaptive immune response. Even without adaptive immunity, “immune priming” allows organisms to survive a second infection more effectively after an initial, non-lethal infection. We used Drosophila melanogaster to study the transcriptional program that underlies priming. Using an insect-derived strain of Gram-positive Enterococcus faecalis , we found a low dose infection enhances survival of a subsequent high dose infection. The enhanced survival in primed animals does not correlate with a decreased bacterial load, implying that the organisms tolerate, rather than resist the infection. We measured the transcriptome associated with immune priming in the fly immune organs: the fat body and hemocytes. We found many genes that were only upregulated in re-infected flies. In contrast, there are very few genes that either remained transcriptionally active throughout the experiment or more efficiently re-activated upon reinfection. Measurements of priming in immune deficient mutants revealed IMD signaling is largely dispensable for responding to a single infection, but needed to fully prime; while Toll signaling is required to respond to a single infection, but dispensable for priming. Overall, we found a primed immune response to E. faecalis relies on immune tolerance rather than bacterial resistance and drives a unique transcriptional response.

Abstract Shadow enhancers, groups of seemingly redundant enhancers, are found in a wide range of organisms and are critical for robust developmental patterning. However, their mechanism of action is unknown. We hypothesized that shadow enhancers drive consistent expression levels by buffering upstream noise through a separation of transcription factor (TF) inputs at the individual enhancers. By measuring transcriptional dynamics of several Kruppel shadow enhancer configurations in live Drosophila embryos, we showed individual member enhancers act largely independently. We found that TF fluctuations are an appreciable source of noise that the shadow enhancer pair can better buffer than duplicated enhancers. The shadow enhancer pair is uniquely able to maintain low levels of expression noise across a wide range of temperatures. A stochastic model demonstrated the separation of TF inputs is sufficient to explain these findings. Our results suggest the widespread use of shadow enhancers is partially due to their noise suppressing ability.

Summary Transgenic reporters allow the measurement of regulatory DNA activity in vivo and consequently have long been useful tools in the study of enhancers. Despite the utility of transgenic reporters, few studies have investigated the potential effects these reporters have on the expression of other transgenic reporters or endogenous genes. A full understanding of the impacts transgenic reporters have on expression is required for accurate interpretation of transgenic reporter data and characterization of gene regulatory mechanisms. Here, we investigate the impact transgenic reporters have on the expression of other transgenic reporters and endogenous genes. By measuring the expression of Kruppel ( Kr ) enhancer reporters in live Drosophila embryos that contain either one or two copies of identical reporters, we find reporters have an inhibitory effect on one another’s expression. Further, expression of a nearby endogenous gene is decreased in the presence of a Kr enhancer reporter. Through the use of competitor binding site arrays, we present evidence that reporters, and potentially endogenous genes, are competing for transcription factors (TFs). Increasing the number of competitor Bcd binding sites decreases the peak levels and spatial extent of Bcd-regulated enhancer reporters’ expression. To understand how small numbers of added TF binding sites could impact gene expression to the extent we observe, we develop a simple thermodynamic model of our system. Our model predicts competition of the measured magnitude specifically if TF binding is restricted to distinct nuclear subregions, underlining the importance of the non-homogenous nature of the nucleus in regulating gene expression.

Abstract The innate immune system is critical for host survival of infection. Infection models in organisms like Drosophila melanogaster are key for understanding evolution and dynamics of innate immunity. However, current toolsets for fly infection studies are limited in their throughput and their ability to generate longitudinal measurements of infection progression in single animals. Here we report a novel bioluminescent imaging strategy enabling non-invasive characterization of pathogen load over time. We demonstrate that photon flux from autobioluminescent reporter bacteria can be used to monitor relative pathogen loads in individual animals. Escherichia coli expressing the ilux operon were imaged in whole, living flies at relevant concentrations for immune study. Because animal sacrifice was not necessary to estimate pathogen load, stochastic responses to infection were characterized in individuals over time for the first time. The high temporal resolution of bioluminescence imaging also enabled visualization of the fine dynamics of microbial clearance on the hours time-scale. Overall, this non-invasive imaging strategy provides a simple and scalable platform to observe changes in pathogen load in vivo over time.

DNA-binding proteins control many fundamental biological processes such as transcription, recombination and replication. A major goal is to decipher the role that DNA sequence plays in orchestrating the binding and activity of such regulatory proteins. To address this goal, it is useful to rationally design DNA sequences with desired numbers, affinities and arrangements of protein binding sites. However, removing binding sites from DNA is computationally non-trivial since one risks creating new sites in the process of deleting or moving others. Here we present an online binding site removal tool, SiteOut, that enables users to design arbitrary DNA sequences that entirely lack binding sites for factors of interest. SiteOut can also be used to delete sites from a specific sequence, or to introduce site-free spacers between functional sequences without creating new sites at the junctions. In combination with commercial DNA synthesis services, SiteOut provides a powerful and flexible platform for synthetic projects that interrogate regulatory DNA. Here we describe the algorithm and illustrate the ways in which SiteOut can be used; it is publicly available at https://depace.med.harvard.edu/siteout/

Abstract Enhancers are DNA sequences composed of transcription factor binding sites that drive complex patterns of gene expression in space and time. Until recently, studying enhancers in their genomic context was technically challenging. Therefore, minimal enhancers, the shortest pieces of DNA that can drive an expression pattern that resembles a gene’s endogenous pattern, are often used to study features of enhancer function. However, evidence suggests that some enhancers require sequences outside the minimal enhancer to maintain function under environmental perturbations. We hypothesized that these additional sequences also prevent misexpression caused by a transcription factor binding site mutation within a minimal enhancer. Using the Drosophila melanogaster even-skipped stripe 2 enhancer as a case study, we tested the effect of a Giant binding site mutation (gt-2) on the expression patterns driven by minimal and extended enhancer reporter constructs. We found that, in contrast to the misexpression caused by the gt-2 binding site mutation in the minimal enhancer, the same gt-2 binding site mutation in the extended enhancer did not have an effect on expression. The buffering of expression levels, but not expression pattern, is partially explained by an additional Giant binding site outside the minimal enhancer. Mutating the gt-2 binding site in the endogenous locus had no significant effect on stripe 2 expression. Our results indicate that rules derived from mutating enhancer reporter constructs may not represent what occurs in the endogenous context.

Complex spatiotemporal gene expression patterns direct the development of the fertilized egg into an adult animal. Comparisons across species show that, in spite of changes in the underlying regulatory DNA sequence, developmental programs can be maintained across millions of years of evolution. Reciprocally, changes in gene expression can be used to generate morphological novelty. Distinguishing between changes in regulatory DNA that lead to changes in gene expression and those that do not is therefore a central goal of evolutionary developmental biology. Quantitative, spatially-resolved measurements of developmental gene expression patterns play a crucial role in this goal, enabling the detection of subtle phenotypic differences between species and the development of computations models that link the sequence of regulatory DNA to expression patterns. Here we report the generation of two atlases of cellular resolution gene expression measurements for the primary anterior-posterior patterning genes in Drosophila simulans and Drosophila virilis. By combining these data sets with existing atlases for three other Drosophila species, we detect subtle differences in the gene expression patterns and dynamics driving the highly conserved axis patterning system and delineate inter-species differences in the embryonic morphology. These data sets will be a resource for future modeling studies of the evolution of developmental gene regulatory networks.