ABSTRACT Cutaneous lupus erythematosus (CLE) is a disfiguring and poorly understood condition frequently associated with systemic lupus. Studies to date suggest that non-lesional keratinocytes play a role in disease predisposition, but this has not been investigated in a comprehensive manner or in the context of other cell populations. To investigate CLE immunopathogenesis, normal-appearing skin, lesional skin, and circulating immune cells from lupus patients were analyzed via integrated single-cell RNA-sequencing and spatial-seq. We demonstrate that normal-appearing skin of lupus patients represents a type I interferon-rich, ‘prelesional’ environment that skews gene transcription in all major skin cell types and dramatically distorts cell-cell communication. Further, we show that lupus-enriched CD16+ dendritic cells undergo robust interferon education in the skin, thereby gaining pro-inflammatory phenotypes. Together, our data provide a comprehensive characterization of lesional and non-lesional skin in lupus and identify a role for skin education of CD16+ dendritic cells in CLE pathogenesis.

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are first responders to tissue injury, where they prime naive T cells. The role of pDCs in physiologic wound repair has been examined, but little is known about pDCs in diabetic wound tissue and their interactions with naive CD4+ T cells. Diabetic wounds are characterized by increased levels of inflammatory IL-17A cytokine, partly due to increased Th17 CD4+ cells. This increased IL-17A cytokine, in excess, impairs tissue repair. Here, using human tissue and murine wound healing models, we found that diabetic wound pDCs produced excess IL-6 and TGF-β and that these cytokines skewed naive CD4+ T cells toward a Th17 inflammatory phenotype following cutaneous injury. Further, we identified that increased IL-6 cytokine production by diabetic wound pDCs is regulated by a histone demethylase, Jumonji AT-rich interactive domain 1C histone demethylase (JARID1C). Decreased JARID1C increased IL-6 transcription in diabetic pDCs, and this process was regulated upstream by an IFN-I/TYK2/JAK1,3 signaling pathway. When inhibited in nondiabetic wound pDCs, JARID1C skewed naive CD4+ T cells toward a Th17 phenotype and increased IL-17A production. Together, this suggests that diabetic wound pDCs are epigenetically altered to increase IL-6 expression that then affects T cell phenotype. These findings identify a therapeutically manipulable pathway in diabetic wounds.

Macrophage (Mφ) plasticity is critical for normal wound repair; however, in type 2 diabetic wounds, Mφs persist in a low-grade inflammatory state that prevents the resolution of wound inflammation. Increased NLRP3 inflammasome activity has been shown in diabetic wound Mφs; however, the molecular mechanisms regulating NLRP3 expression and activity are unclear. Here, we identified that diabetic wound keratinocytes induce Nlrp3 gene expression in wound Mφs through IL-1 receptor-mediated signaling, resulting in enhanced inflammasome activation in the presence of pathogen-associated molecular patterns and damage-associated molecular patterns. We found that IL-1α is increased in human and murine wound diabetic keratinocytes compared with nondiabetic controls and directly induces Mφ Nlrp3 expression through IL-1 receptor signaling. Mechanistically, we report that the histone demethylase, JMJD3, is increased in wound Mφs late post-injury and is induced by IL-1α from diabetic wound keratinocytes, resulting in Nlrp3 transcriptional activation through an H3K27me3-mediated mechanism. Using genetically engineered mice deficient in JMJD3 in myeloid cells (Jmjd3f/flyz2Cre+), we demonstrate that JMJD3 controls Mφ-mediated Nlrp3 expression during diabetic wound healing. Thus, our data suggest a role for keratinocyte-mediated IL-1α/IL-1R signaling in driving enhanced NLRP3 inflammasome activity in wound Mφs. These data also highlight the importance of cell cross-talk in wound tissues and identify JMJD3 and the IL-1R signaling cascade as important upstream therapeutic targets for Mφ NLRP3 inflammasome hyperactivity in nonhealing diabetic wounds.

The sophistication of gene prediction algorithms and the abundance of RNA-based evidence for the maize genome may suggest that manual curation of gene models is no longer necessary. However, quality metrics generated by the MAKER-P gene annotation pipeline identified 17,225 of 130,330 (13%) protein-coding transcripts in the B73 Reference Genome V4 gene set with models of low concordance to available biological evidence. Working with eight graduate students, we used the Apollo annotation editor to curate 86 transcript models flagged by quality metrics and a complimentary method using the Gramene gene tree visualizer. All of the triaged models had significant errors, including missing or extra exons, non-canonical splice sites, and incorrect UTRs. A correct transcript model existed for about 60% of genes (or transcripts) flagged by quality metrics; we attribute this to the convention of elevating the transcript with the longest coding sequence (CDS) to the canonical, or first, position. The remaining 40% of flagged genes resulted in novel annotations and represent a manual curation space of about 10% of the maize genome (~4,000 protein-coding genes). MAKER-P metrics have a specificity of 100%, and a sensitivity of 85%; the gene tree visualizer has a specificity of 100%. Together with the Apollo graphical editor, our double triage provides an infrastructure to support the community curation of eukaryotic genomes by scientists, students, and potentially even citizen scientists.

Abstract Cutaneous lupus is commonly present in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) but can also exist as an isolated manifestation without further systemic involvement. T cells have been strongly suspected to contribute to the pathology of cutaneous lupus, yet our understanding of the T cell phenotypes and functions in the skin in lupus remains incomplete, and the extent to which lupus T cell infiltrates in skin resemble those in other tissue beds is unknown. Here, we present a detailed single-cell RNA sequencing profile of T and NK cell populations present within lesional and non-lesional skin biopsies of patients with cutaneous lupus. We identified multiple lymphocyte clusters, including both CD4 and CD8 T cells, NK cells, regulatory T cells, and a population of strongly interferon-responding cells that was present in patients with cutaneous lupus but absent in healthy donors. T cells across clusters from both lesional and non-lesional skin biopsies expressed elevated levels of interferon simulated genes (ISGs); however, compared to T cells from control skin, T cells from cutaneous lupus lesions did not show elevated expression profiles of activation, cytotoxicity, or exhaustion. Integrated analyses comparing skin T/NK cells to lupus nephritis kidney T/NK cells indicated that skin lymphocytes appeared less activated and lacked the expanded cytotoxic populations prominent in lupus nephritis. An integrated comparison of skin T cells from lupus and systemic sclerosis revealed similar activation profiles but an elevated ISG signature specific to cells from lupus skin biopsies. Overall, these data represent the first detailed transcriptomic analysis of the of T and NK cells in cutaneous lupus at the single cell level and have enabled a cross-tissue comparison that highlighted the stark differences in composition and activation of T/NK cells in distinct tissues in lupus.

Stiff skin syndrome (SSS) is a rare (<100 reported cases), slowly progressive skin condition, caused by genetic mutation in the FBN1gene. It is characterized by thickened skin associated with muscle weakness and limited joint mobility. Currently there is no known treatment. While SSS is considered as scleroderma (Sc)-like disorder, there has not been any molecular study conducted to investigate the potential differences or similarities between the two diseases. Here, we report molecular profiling for the skin biopsies of 3 stiff skin syndrome and 3 scleroderma patients using bulk RNA-seq and single cell RNA-seq (scRNA-seq) techniques. We revealed >4,000 genes being differentially expressed in SSS skin that are highly correlated with genes dysregulated in scleroderma (Sc) skin. In stark contrast to scleroderma, which showed enrichment of myofibroblasts, there was marked enrichment of pericytes (distinguished by the expression of RGS5) in the dermal layer of SSS (10% in Sc versus >30% in SSS), confirmed by IHC. We also demonstrate expression of the therapeutically targetable adrenergic receptors (i.e. ADRA1D,ADRA2B) in pericytes, and ABCA1in fibroblasts in SSS. Previous work has suggested ADRA signaling as a promoter of fibroblast differentiation in smooth muscle. When restricting to SSS-dysregulated genes that are not differentially expressed in Sc, we identified fibroblast-expressing FGFR4(fibroblast growth factor receptor 4) as the most significantly up-regulated gene (FC=6.2; p=1.2x10-15). Our transcriptomic study illustrates the largely similar but subtle molecular differences between SSS and Sc and demonstrates that identification of dysregulated disease specific pathways can potentially facilitate the identification of therapeutic targets.