Abstract Microglia are highly motile glial cells that are proposed to mediate synaptic pruning during neuronal circuit formation. Disruption of signaling between microglia and neurons leads to an excess of immature synaptic connections, thought to be the result of impaired phagocytosis of synapses by microglia. However, until now the direct phagocytosis of synapses by microglia has not been reported and fundamental questions remain about the precise synaptic structures and phagocytic mechanisms involved. Here we used light sheet fluorescence microscopy to follow microglia–synapse interactions in developing organotypic hippocampal cultures, complemented by a 3D ultrastructural characterization using correlative light and electron microscopy (CLEM). Our findings define a set of dynamic microglia–synapse interactions, including the selective partial phagocytosis, or trogocytosis ( trogo -: nibble), of presynaptic structures and the induction of postsynaptic spine head filopodia by microglia. These findings allow us to propose a mechanism for the facilitatory role of microglia in synaptic circuit remodeling and maturation.

A global concern has emerged with the pandemic spread of Zika virus (ZIKV) infections that can cause severe neurological symptoms in adults and newborns. ZIKV is a positive-strand RNA virus replicating in virus-induced membranous replication factories (RFs). Here we used various imaging techniques to investigate the ultrastructural details of ZIKV RFs and their relationship with host cell organelles. Analyses of human hepatic cells and neural progenitor cells infected with ZIKV revealed endoplasmic reticulum (ER) membrane invaginations containing pore-like openings toward the cytosol, reminiscent to RFs in Dengue virus-infected cells. Both the MR766 African strain and the H/PF/2013 Asian strain, the latter linked to neurological diseases, induce RFs of similar architecture. Importantly, ZIKV infection causes a drastic reorganization of microtubules and intermediate filaments forming cage-like structures surrounding the viral RF. Consistently, ZIKV replication is suppressed by cytoskeleton-targeting drugs. Thus, ZIKV RFs are tightly linked to rearrangements of the host cell cytoskeleton.

Lipid droplets (LDs) are dynamic cellular organelles that control many biological processes. However, molecular components determining LD growth are poorly understood. Genetic analysis has indicated that Fsp27, an LD-associated protein, is important in controlling LD size and lipid storage in adipocytes. In this paper, we demonstrate that Fsp27 is focally enriched at the LD–LD contacting site (LDCS). Photobleaching revealed the occurrence of lipid exchange between contacted LDs in wild-type adipocytes and Fsp27-overexpressing cells but not Fsp27-deficient adipocytes. Furthermore, live-cell imaging revealed a unique Fsp27-mediated LD growth process involving a directional net lipid transfer from the smaller to larger LDs at LDCSs, which is in accordance with the biophysical analysis of the internal pressure difference between the contacting LD pair. Thus, we have uncovered a novel molecular mechanism of LD growth mediated by Fsp27.

Control of lipid droplet (LD) nucleation and copy number are critical, yet poorly understood, processes. We use model peptides that shift from the endoplasmic reticulum (ER) to LDs in response to fatty acids to characterize the initial steps of LD formation occurring in lipid-starved cells. Initially, arriving lipids are rapidly packed in LDs that are resistant to starvation (pre-LDs). Pre-LDs are restricted ER microdomains with a stable core of neutral lipids. Subsequently, a first round of "emerging" LDs is nucleated, providing additional lipid storage capacity. Finally, in proportion to lipid concentration, new rounds of LDs progressively assemble. Confocal microscopy and electron tomography suggest that emerging LDs are nucleated in a limited number of ER microdomains after a synchronized stepwise process of protein gathering, lipid packaging, and recognition by Plin3 and Plin2. A comparative analysis demonstrates that the acyl-CoA synthetase 3 is recruited early to the assembly sites, where it is required for efficient LD nucleation and lipid storage.

Phosphatidylserine (PS) plays a central role in cell signaling and in the biosynthesis of other lipids. To date, however, the subcellular distribution and transmembrane topology of this crucial phospholipid remain ill-defined. We transfected cells with a GFP-tagged C2 domain of lactadherin to detect by light and electron microscopy PS exposed on the cytosolic leaflet of the plasmalemma and organellar membranes. Cytoplasmically exposed PS was found to be clustered on the plasma membrane, and to be associated with caveolae, the trans-Golgi network, and endocytic organelles including intraluminal vesicles of multivesicular endosomes. This labeling pattern was compared with the total cellular distribution of PS as visualized using a novel on-section technique. These complementary methods revealed PS in the interior of the ER, Golgi complex, and mitochondria. These results indicate that PS in the lumenal monolayer of the ER and Golgi complex becomes exposed cytosolically at the trans-Golgi network. Transmembrane flipping of PS may contribute to the exit of cargo from the Golgi complex.

Pathogenesis induced by SARS-CoV-2 is thought to result from both an inflammation-dominated cytokine response and virus-induced cell perturbation causing cell death. Here, we employ an integrative imaging analysis to determine morphological organelle alterations induced in SARS-CoV-2-infected human lung epithelial cells. We report 3D electron microscopy reconstructions of whole cells and subcellular compartments, revealing extensive fragmentation of the Golgi apparatus, alteration of the mitochondrial network and recruitment of peroxisomes to viral replication organelles formed by clusters of double-membrane vesicles (DMVs). These are tethered to the endoplasmic reticulum, providing insights into DMV biogenesis and spatial coordination of SARS-CoV-2 replication. Live cell imaging combined with an infection sensor reveals profound remodeling of cytoskeleton elements. Pharmacological inhibition of their dynamics suppresses SARS-CoV-2 replication. We thus report insights into virus-induced cytopathic effects and provide alongside a comprehensive publicly available repository of 3D datasets of SARS-CoV-2-infected cells for download and smooth online visualization.

Abstract Lipid droplets (LDs) are intracellular organelles that provide fatty acids (FAs) to cellular processes including synthesis of membranes and production of metabolic energy. While known to move bidirectionally along microtubules (MTs), the role of LD motion and whether it facilitates interaction with other organelles are unclear. Here we show that during nutrient starvation, LDs and mitochondria relocate on detyrosinated MT from the cell centre to adopt a dispersed distribution. In the cell periphery, LD–mitochondria interactions increase and LDs efficiently supply FAs for mitochondrial beta-oxidation. This cellular adaptation requires the activation of the energy sensor AMPK, which in response to starvation simultaneously increases LD motion, reorganizes the network of detyrosinated MTs and activates mitochondria. In conclusion, we describe the existence of a specialized cellular network connecting the cellular energetic status and MT dynamics to coordinate the functioning of LDs and mitochondria during nutrient scarcity.

With no antiviral drugs or widely available vaccines, Dengue virus (DENV) constitutes a public health concern. DENV replicates at ER-derived cytoplasmic structures that include substructures called convoluted membranes (CMs); however, the purpose of these membrane alterations remains unclear. We determine that DENV nonstructural protein (NS)4B, a promising drug target with unknown function, associates with mitochondrial proteins and alters mitochondria morphology to promote infection. During infection, NS4B induces elongation of mitochondria, which physically contact CMs. This restructuring compromises the integrity of mitochondria-associated membranes, sites of ER-mitochondria interface critical for innate immune signaling. The spatio-temporal parameters of CM biogenesis and mitochondria elongation are linked to loss of activation of the fission factor Dynamin-Related Protein-1. Mitochondria elongation promotes DENV replication and alleviates RIG-I-dependent activation of interferon responses. As Zika virus infection induces similar mitochondria elongation, this perturbation may protect DENV and related viruses from innate immunity and create a favorable replicative environment.

Abstract Phytoplankton is a minor fraction of the global biomass playing a major role in primary production and climate. Despite improved understanding of phytoplankton diversity and genomics, we lack nanoscale subcellular imaging approaches to understand their physiology and cell biology. Here, we present a complete Focused Ion Beam - Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM) workflow (from sample preparation to image processing) to generate nanometric 3D phytoplankton models. Tomograms of entire cells, representatives of six ecologically-successful phytoplankton unicellular eukaryotes, were used for quantitative morphometric analysis. Besides lineage-specific cellular architectures, we observed common features related to cellular energy management: i) conserved cell-volume fractions occupied by the different organelles; ii) consistent plastid-mitochondria interactions, iii) constant volumetric ratios in these energy-producing organelles. We revealed detailed subcellular features related to chromatin organization and to biomineralization. Overall, this approach opens new perspectives to study phytoplankton acclimation responses to abiotic and biotic factors at a relevant biological scale.

Abstract Microglia are highly motile glial cells that are proposed to mediate synaptic pruning during neuronal circuit formation. Disruption of signaling between microglia and neurons leads to an excess of immature synaptic connections, thought to be the result of impaired phagocytosis of synapses by microglia. However, until now the direct phagocytosis of synapses by microglia has not been reported and fundamental questions remain about the precise synaptic structures and phagocytic mechanisms involved. Here we used light sheet fluorescence microscopy to follow microglia-synapse interactions in developing organotypic hippocampal cultures, complemented by three-dimensional ultrastructural characterization using correlative light and electron microscopy (CLEM). Our findings define a set of dynamic microglia-synapse interactions, including the selective partial phagocytosis, or trogocytosis ( trogo- : nibble), of presynaptic structures and the induction of postsynaptic spine head filopodia by microglia. These findings allow us to propose a mechanism for the facilitatory role of microglia in synaptic circuits remodeling and maturation.