Abstract We designed and engineered mitochondrially targeted obligate heterodimeric zinc finger nucleases (mt ZFN s) for site‐specific elimination of pathogenic human mitochondrial DNA (mt DNA ). We used mt ZFN s to target and cleave mt DNA harbouring the m.8993T>G point mutation associated with neuropathy, ataxia, retinitis pigmentosa ( NARP ) and the “common deletion” ( CD ), a 4977‐bp repeat‐flanked deletion associated with adult‐onset chronic progressive external ophthalmoplegia and, less frequently, Kearns‐Sayre and Pearson's marrow pancreas syndromes. Expression of mt ZFN s led to a reduction in mutant mt DNA haplotype load, and subsequent repopulation of wild‐type mt DNA restored mitochondrial respiratory function in a CD cybrid cell model. This study constitutes proof‐of‐principle that, through heteroplasmy manipulation, delivery of site‐specific nuclease activity to mitochondria can alleviate a severe biochemical phenotype in primary mitochondrial disease arising from deleted mt DNA species.

Mutations of the mitochondrial genome (mtDNA) underlie a substantial portion of mitochondrial disease burden. These disorders are currently incurable and effectively untreatable, with heterogeneous penetrance, presentation and prognosis. To address the lack of effective treatment for these disorders, we exploited a recently developed mouse model that recapitulates common molecular features of heteroplasmic mtDNA disease in cardiac tissue: the m.5024C>T tRNAAla mouse. Through application of a programmable nuclease therapy approach, using systemically administered, mitochondrially targeted zinc-finger nucleases (mtZFN) delivered by adeno-associated virus, we induced specific elimination of mutant mtDNA across the heart, coupled to a reversion of molecular and biochemical phenotypes. These findings constitute proof of principle that mtDNA heteroplasmy correction using programmable nucleases could provide a therapeutic route for heteroplasmic mitochondrial diseases of diverse genetic origin.

We describe six persons from three families with three homozygous protein truncating variants in PUS7: c.89_90del (p.Thr30Lysfs^∗20), c.1348C>T (p.Arg450^∗), and a deletion of the penultimate exon 15. All these individuals have intellectual disability with speech delay, short stature, microcephaly, and aggressive behavior. PUS7 encodes the RNA-independent pseudouridylate synthase 7. Pseudouridylation is the most abundant post-transcriptional modification in RNA, which is primarily thought to stabilize secondary structures of RNA. We show that the disease-related variants lead to abolishment of PUS7 activity on both tRNA and mRNA substrates. Moreover, pus7 knockout in Drosophila melanogaster results in a number of behavioral defects, including increased activity, disorientation, and aggressiveness supporting that neurological defects are caused by PUS7 variants. Our findings demonstrate that RNA pseudouridylation by PUS7 is essential for proper neuronal development and function.

Summary The Tricarboxylic Acid Cycle (TCA) cycle is arguably the most critical metabolic cycle in physiology and exists as an essential interface coordinating cellular metabolism, bioenergetics, and redox homeostasis. Despite decades of research, a comprehensive investigation into the consequences of TCA cycle dysfunction remains elusive. Here, we targeted two TCA cycle enzymes, fumarate hydratase (FH) and succinate dehydrogenase (SDH), and combined metabolomics, transcriptomics, and proteomics analyses to fully appraise the consequences of TCA cycle inhibition (TCAi) in kidney epithelial cells. Our comparative approach shows that TCAi elicits a convergent rewiring of redox and amino acid metabolism dependent on the activation of ATF4 and the integrated stress response (ISR). Furthermore, we also uncover a divergent metabolic response, whereby acute FHi, but not SDHi, can maintain asparagine levels via reductive carboxylation and maintenance of cytosolic aspartate synthesis. Our work highlights an important interplay between the TCA cycle, redox biology and amino acid homeostasis. Highlights TCA cycle inhibition promotes GSH synthesis and impairs de novo aspartate and proline synthesis Disruption of mitochondrial thiol redox homeostasis phenocopies TCA cycle inhibition by promoting GSH synthesis and impairing proline and aspartate synthesis Acute FHi, but not SDHi, can maintain asparagine levels via reductive carboxylation and maintenance of cytosolic aspartate synthesis TCA cycle inhibition mimics an amino acid deprivation-type response and activates ATF4 via the integrated stress response to maintain redox and amino acid homeostasis

Abstract Mitochondrial gene expression relies on mitoribosomes to translate mitochondrial mRNAs. The biogenesis of mitoribosomes is an intricate process involving multiple assembly factors. Among these factors, GTP-binding proteins (GTPBPs) play important roles. In bacterial systems, numerous GTPBPs are required for ribosome subunit maturation, with EngB being a GTPBP involved in the ribosomal large subunit assembly. In this study, we focus on exploring the function of GTPBP8, the human homolog of EngB. We find that ablation of GTPBP8 leads to the inhibition of mitochondrial translation, resulting in significant impairment of oxidative phosphorylation. Structural analysis of mitoribosomes from GTPBP8 knock-out cells shows the accumulation of mitoribosomal large subunit assembly intermediates that are incapable of forming functional monosomes. Furthermore, fPAR-CLIP analysis reveals that GTPBP8 is an RNA-binding protein that interacts specifically with the mitochondrial ribosome large subunit 16 S rRNA. Our study highlights the role of GTPBP8 as a component of the mitochondrial gene expression machinery involved in mitochondrial large subunit maturation.

SUMMARY The epitranscriptome plays a key regulatory role in cellular processes in health and disease, including ribosome biogenesis. Here, analysis of the human mitochondrial transcriptome shows that 2’- O -methylation is limited to residues of the mitoribosomal large subunit (mtLSU) 16S mt-rRNA, modified by MRM1, MRM2, and MRM3. Ablation of MRM2 leads to a severe impairment of the oxidative phosphorylation system, caused by defective mitochondrial translation and accumulation of mtLSU assembly intermediates. Structures of these particles (2.58 Å) present disordered RNA domains, partial occupancy of bL36m and bound MALSU1:L0R8F8:mtACP anti-association module. Additionally, we present five mtLSU assembly states with different intersubunit interface configurations. Complementation studies demonstrate that the methyltransferase activity of MRM2 is dispensable for mitoribosome biogenesis. The Drosophila melanogaster orthologue, DmMRM2 , is an essential gene, with its knock-down leading to developmental arrest. This work identifies a key late-stage quality control step during mtLSU assembly, ultimately contributing to the maintenance of mitochondrial homeostasis.

Maintenance and expression of mitochondrial DNA is indispensable for proper function of the oxidative phosphorylation machinery. Post-transcriptional modification of mitochondrial RNA has emerged as one of the key regulatory steps of human mitochondrial gene expression. Mammalian NOP2/Sun RNA Methyltransferase Family Member 2 (NSUN2) has been characterised as an RNA methyltransferase that introduces 5-methylcytosine (m5C) in nuclear-encoded tRNAs, mRNAs, microRNA and noncoding RNAs. In these roles, NSUN2 has been associated with cell proliferation and differentiation. Pathogenic variants in NSUN2 have been linked with neurodevelopmental disorders. Here we employ spatially restricted proximity labelling and immunodetection to demonstrate that NSUN2 is imported into the matrix of mammalian mitochondria. Using three genetic models for NSUN2 inactivation – knockout mice, patient-derived fibroblasts and CRISPR/Cas9 knockout in human cells – we show that NSUN2 in necessary for the generation of m5C at positions 48, 49 and 50 of several mammalian mitochondrial tRNAs. Finally, we show that inactivation of NSUN2 does not have a profound effect on mitochondrial tRNA stability and oxidative phosphorylation in differentiated cells. We discuss the importance of the newly discovered function of NSUN2 in the context of human disease.

RNA species play host to a plethora of post-transcriptional modifications which together make up the epitranscriptome. 5-methyluridine (m5U) is one of the most common modifications made to cellular RNA, where it is found almost ubiquitously in bacterial and eukaryotic cytosolic tRNAs at position 54. Here, we demonstrate that m5U54 in human mitochondrial tRNAs is catalysed by the nuclear-encoded enzyme TRMT2B, and that its repertoire of substrates is expanded to ribosomal RNAs, catalysing m5U429 in 12S rRNA. We show that TRMT2B is not essential for viability in human cells and that knocking-out the gene shows no obvious phenotype with regards to RNA stability, mitochondrial translation, or cellular growth.

Abstract Mitochondrial DNA (mtDNA) encodes the core subunits for OXPHOS and is essential in eukaryotes. mtDNA is packed into distinct foci (nucleoids) inside mitochondria, and the number of mtDNA differs between cell-types, and is affected in several human diseases. Today, common protocols estimate per-cell mtDNA-molecule numbers by sequencing or qPCR from bulk samples. However, this does not allow insight into cell-to-cell heterogeneity and can mask phenotypical sub-populations. Here, we present mtFociCounter , a single-cell image-analysis tool for reproducible quantification of nucleoids and other foci. mtFociCounter is a light-weight, open-source freeware and overcomes current limitations to reproducible single-cell analysis of mitochondrial foci. We demonstrate its use by analysing 2165 single fibroblasts, and observe a large cell-to-cell heterogeneity in nucleoid numbers. In addition, mtFociCounter quantifies mitochondrial content and our results show good correlation (R=0.90) between nucleoid number and mitochondrial area, and we find nucleoid density is less variable than nucleoid numbers in wild-type cells. Finally, we demonstrate mtFociCounter readily detects differences in foci numbers upon sample-treatment, and applies to superresolution microscopy. Together, we present mtFociCounter as a solution to reproducibly quantify cellular foci in single cells and our results highlight the importance of accounting for cell-to-cell variance and mitochondrial context in mitochondrial nucleoid analysis.

Mitochondrial DNA (mtDNA) copy numbers fluctuate over time due to stochastic cellular dynamics. Understanding mtDNA dynamics and the accumulation of mutations is vital for understanding mitochondrial-related diseases. Here, we use stochastic modelling to derive general results for the impact of cellular control on mtDNA populations, the cost to the cell of different mtDNA states, and the optimisation of therapeutic control of mtDNA populations. We provide theoretical evidence that an increasing mtDNA variance can increase the energetic cost of maintaining a tissue, that intermediate levels of heteroplasmy can be more detrimental than homoplasmy even for a dysfunctional mutant, that heteroplasmy distribution (not mean alone) is crucial for the success of gene therapies, and that long-term rather than short intense gene therapies are more likely to beneficially impact mtDNA populations. New experiments validate our predictions on heteroplasmy dependence of therapeutic outcomes.