Abstract Systematic and extensive investigation of enzymes is needed to understand their extraordinary efficiency and meet current challenges in medicine and engineering. We present HT-MEK, a microfluidic platform for high-throughput expression, purification, and characterization of >1500 enzyme variants per experiment. For 1036 mutants of the alkaline phosphatase PafA, we performed >670,000 reactions to determine >5000 kinetic and physical constants for multiple substrates and inhibitors. These constants allowed us to uncover extensive kinetic partitioning to a misfolded state and isolate catalytic effects, revealing spatially contiguous “regions” of residues linked to particular aspects of function. These regions included active-site proximal residues but also extended to the enzyme surface, providing a map of underlying architecture that could not be derived from existing approaches. HT-MEK, using direct and coupled fluorescent assays, has future applications to a wide variety of problems ranging from understanding molecular mechanisms to medicine to engineering and design. One Sentence Summary HT-MEK, a microfluidic platform for high-throughput, quantitative biochemistry, reveals enzyme architectures shaping function.

Summary Transcription factors (TFs) bind regulatory DNA to control gene expression, and mutations to either TFs or DNA can alter binding affinities to rewire regulatory networks and drive phenotypic variation. While studies have profiled energetic effects of DNA mutations extensively, we lack similar information for TF variants. Here, we present STAMMP (Simultaneous Transcription Factor Affinity Measurements via Microfluidic Protein Arrays), a high-throughput microfluidic platform enabling quantitative characterization of hundreds of TF variants simultaneously. Measured affinities for ∼210 mutants of a model yeast TF (Pho4) interacting with 9 oligonucleotides (>1,800 K d s) reveal that many combinations of mutations to poorly conserved TF residues and nucleotides flanking the core binding site alter but preserve physiological binding, providing a mechanism for mutations in cis and trans to rewire networks without insurmountable evolutionary penalties. Moreover, biochemical double-mutant cycles across the TF-DNA interface reveal molecular mechanisms driving recognition, linking sequence to function.

Abstract Using High-Throughput Microfluidic Enzyme Kinetics (HT-MEK), we measured over 9,000 inhibition curves detailing impacts of 1,004 single-site mutations throughout the Alkaline Phosphatase PafA on binding affinity for two transition state analogs (TSAs), vanadate and tungstate. As predicted by catalytic models invoking transition state complementary, mutations to active site and active site-contacting residues had highly similar impacts on catalysis and TSA binding. Unexpectedly, most mutations to more distal residues which reduced catalysis had little or no impact on TSA binding and many even increased affinity for tungstate. These disparate effects are accounted for by a model in which distal mutations alter the enzyme’s conformational landscape and increase occupancy of microstates that are catalytically less effective but better able to accommodate larger transition state analogs. In support of this model, glycine substitutions (rather than valine) were more likely to increase tungstate affinity, presumably due to increased conformational flexibility and increased occupancy of previously disfavored microstates. These results indicate that residues throughout an enzyme provide specificity for the transition state and discriminate against analogs that are larger only by tenths of an Ångström. Thus, engineering enzymes that rival the most powerful natural enzymes will likely require consideration not just of residues in and around the active site, but also of more distal residues that shape the enzyme’s conformational landscape and finetune the active site. In addition, the extensive functional communication between the active site and remote residues may provide interconnections needed for allostery and make allostery a highly evolvable trait. Significance Statement Transition state analogs (TSAs) resemble fleeting high-energy transition states and have been used to inhibit enzymes in nature and medicine, to learn about enzyme active site features, and to design and select new enzymes. While TSAs mimic transition states, they differ from actual TSs, and we exploit these differences here. Systematic TSA affinity measurements for 1,004 mutants of PafA (a model phosphatase enzyme) revealed effects in and around the active site that mirror their effects on catalysis, but TSA-binding and catalytic effects diverge more distally. These observations suggest that residues throughout an enzyme adjust its conformational landscape on the tenth-Ångström scale to optimize the active site for catalysis, rendering allostery more evolvable in nature but likely complicating enzyme design.

Microfluidic technologies have been used across diverse disciplines (e.g. high-throughput biological measurement, fluid physics, laboratory fluid manipulation) but widespread adoption has been limited due to the lack of openly disseminated resources that enable non-specialist labs to make and operate their own devices. Here, we report the open-source build of a pneumatic setup capable of operating both single and multilayer (Quake-style) microfluidic devices with programmable scripting automation. This setup can operate both simple and complex devices with 48 device valve control inputs and 18 sample inputs, with modular design for easy expansion, at a fraction of the cost of similar commercial solutions. We present a detailed step-by-step guide to building the pneumatic instrumentation, as well as instructions for custom device operation using our software, Geppetto, through an easy-to-use GUI for live on-chip valve actuation and a scripting system for experiment automation. We show robust valve actuation with near real-time software feedback and demonstrate use of the setup for high-throughput biochemical measurements on-chip. This open-source setup will enable specialists and novices alike to run microfluidic devices easily in their own laboratories.