Abstract Soil DNA extraction encounters numerous challenges that can affect both yield and purity of the recovered DNA. Clay particles lead to reduced DNA extraction efficiency, and PCR inhibitors from the soil matrix can negatively affect downstream analyses when applying DNA sequencing. Further, these effects impede molecular analysis of bacterial community compositions in lower biomass samples, as often observed in deeper soil layers. Many studies avoid these complications by using indirect DNA extraction with prior separation of the cells from the matrix, but such methods introduce other biases that influence the resulting microbial community composition. To address these issues, a direct DNA extraction method was applied in combination with the use of a commercial product, the G2 DNA/RNA Enhancer ® , marketed as being capable of improving the amount of DNA recovered after the lysis step. The results showed that application of G2 increased DNA yields from the studied clayey soils from layers between 1.00 and 2.20 m below ground level. Importantly, the use of G2 did not introduce bias, as it did not result in any significant differences in the biodiversity of the bacterial community measured in terms of alpha and beta diversity and taxonomical composition. Finally, this study considered a set of customised lysing tubes for evaluating possible influences on the DNA yield. Tubes customization included different bead sizes and amounts, along with lysing tubes coming from two suppliers. Results showed that the lysing tubes with mixed beads allowed greater DNA recovery compared to the use of either 0.1 or 1.4 mm beads, irrespective of the tube supplier. These outcomes may help to improve commercial products in DNA/RNA extraction kits, besides raising awareness about the optimal choice of additives, offering opportunities for acquiring a better understanding of topics such as vertical microbial characterisation and environmental DNA recovery in low biomass samples.

ABSTRACT Drinking water resources, such as groundwater, are threatened by pollution. The pesticide metabolite 2,6-dichlorobenzamide (BAM) is one of the compounds frequently found in groundwater. Studies have attempted to add specific BAM-degrading bacteria to sand-filters at drinking water treatment facilities. This biotechnology has shown great potential in removing BAM from contaminated water. However, the degradation potential was formerly lost after approximately 2-3 weeks due to a decrease of the degrader population over time. The aim of the present study was to overcome the constraints leading to loss of degraders from inoculated filters. Our approach was threefold: 1) Development of a novel inoculation strategy, 2) lowering the flowrate to reduce washout of cells, and 3) increasing the concentration of nutrients hereunder the pollutant in a smaller inlet water stream. The two latter were achieved via modifications of the inlet water by applying membrane treatment which, besides producing an ultra-pure water fraction, produced a residual water stream with nutrients including BAM concentrated in an approximately 10-fold reduced volume. This was done to alleviate starvation of degrader bacteria in the otherwise oligotrophic sand-filters and to enable a decreased flowrate. By this approach, we achieved 100% BAM removal over a period of 40 days in sand-filter columns inoculated with the BAM-degrader Aminobacter sp. MSH1. Molecular targeting of the degrader strain showed that the population of degrader bacteria persisted at high numbers throughout the sand-filter columns and over the entire timespan of the experiment. 16S rRNA gene amplicon sequencing confirmed that MSH1 dominated the bacterial communities. IMPORTANCE Many countries rely partly or solely on groundwater as the source of drinking water. Here groundwater contamination by pesticide residues poses a serious threat to the production of high quality drinking water. Since scarcity of clean groundwater may occur in progressively larger areas both locally and globally, the need for efficient purification technologies is growing. This study shows that a novel system combining membrane treatment and bioaugmented sand-filters can efficiently remove pesticide residues in laboratory columns when applying specific inoculation and flow conditions. Once upscaled, this system can be used directly for pump-and-treat of contaminated groundwater wells or at drinking water treatment plants.

Abstract The specific microbial biodiversity linked to a particular vineyard location is reported to be a crucial aspect, in conjunction with edaphic, climatic and human factors, in the concept of wine terroir . These biogeographical patterns are known as microbial terroirs . This study applied an HTS amplicon library approach in order to conduct a global survey of vineyards’ soil microbial communities. In all, soil samples from 200 vineyards on four continents were analysed in an attempt to establish the basis for the development of a vineyard soil microbiome map to represent microbial wine terroirs on a global scale. This study established links between vineyard locations and microbial biodiversity on different scales: between continents and countries, and between different wine regions within the same country. Geography had a strong effect on the composition of microbial communities on a global scale, which was also maintained on a country scale. Furthermore, a predictive model was developed, based on random forest analyses, to discriminate between microbial patterns in order to identify the geographical source of the samples with reasonable precision. Finally this study is the first to describe the microbial community of new and northern wine-producing regions, such as Denmark, that could be of great interest for viticulture adaptation in a context of climate change.

As one of the only described degraders of the recalcitrant metabolite 2,6-dichlorobenzamide (BAM) of the pesticide dichlobenil, Aminobacter sp. MSH1 has been intensively studied for its characteristics with regards to physiology and its use in bioremediation. Two plasmid sequences from strain MSH1 have previously been published, while the remaining genome sequence has been left uninvestigated. We here present the complete genome sequence of this important strain, which consists of a chromosome, two megaplasmids and five smaller plasmids. Intriguingly, the plasmid copy numbers are mostly below one per bacterial chromosome, indicating that plasmids in strain MSH1 are under very unstable conservation. The results of this report improve our understanding of the genomic dynamics of Aminobacter sp. MSH1.

Abstract Aminobacter sp. MSH1 (CIP 110285) can use the pesticide dichlobenil and its transformation product, the recalcitrant groundwater micropollutant, 2,6-dichlorobenzamide (BAM) as sole source of carbon, nitrogen, and energy. The concentration of BAM in groundwater often exceeds the threshold limit for drinking water, resulting in the use of additional treatment in drinking water treatment plants (DWTPs) or closure of the affected abstraction wells. Biological treatment with MSH1 is considered a potential sustainable alternative to remediate BAM-contamination in drinking water production. Combining Illumina and Nanopore sequencing, we here present the complete genome of MSH1, which was determined independently in two different laboratories. Unexpectedly, divergences were observed between the two genomes, i.e. one of them lacked four plasmids compared to the other. Besides the circular chromosome and the two previously described plasmids involved in BAM catabolism pBAM1 (41 kb) and pBAM2 (54 kb), we observe that the genome of MSH1 contains two megaplasmids pUSP1 (367 kb) and pUSP2 (366 kb) and three smaller plasmids pUSP3 (97 kb), pUSP4 (64 kb), and pUSP5 (32 kb). The MSH1 substrain from KU Leuven showed a reduced genome lacking plasmids pUSP2 and the three smaller plasmids and was designated substrain MK1, whereas the variant with all plasmids was designated as substrain DK1. Results of a plasmid stability experiment, indicate that strain MSH1 may have a polyploid chromosome when growing in R2B medium with more chromosomes than plasmids per cell. Based on phylogenetic analyses, strain MSH1 is reassigned as Aminobacter niigataensis MSH1. Importance The complete genomes of the two MSH1 substrains, DK1 and MK1, provide further insight into this already well-studied organism with bioremediation potential. The varying plasmid contents in the two substrains suggest that some of the plasmids are unstable, although this is not supported by the herein described plasmid stability experiment. Instead, results suggest that MSH1 is polyploid with respect to its chromosome, at least under some growth conditions. As the essential BAM-degradation genes are found on some of these plasmids, stable inheritance is essential for continuous removal of BAM. Finally, Aminobacter sp. MSH1 is reassigned as Aminobacter niigataensis MSH1, based on phylogenetic evidence.

Abstract Benzophenone-3 (BP3) is an organic UV filter whose presence in the aquatic environment has been linked to detrimental developmental impacts in aquatic organisms such as coral and fish. The genus Rhodococcus has been extensively studied and is known for possessing large genomes housing genes for biodegradation of a wide range of compounds, including aromatic carbons. Here, we present the genome sequence of Rhodococcus sp. USK10, which was isolated from Chinese riverbank sediment and is capable of utilising BP3 as the sole carbon source, resulting in full BP3 mineralisation. The genome consisted of 9,870,030 bp in 3 replicons, a G+C content of 67.2%, and 9,722 coding DNA sequences (CDSs). Annotation of the genome revealed that 179 of these CDSs are involved in metabolism of aromatic carbons. The complete genome of Rhodococcus sp. USK10 is the first complete, annotated genome sequence of a Benzophenone-3 degrading bacterium. Through radiolabelling, it is also the first bacterium proven to mineralise Benzophenone-3. Due to the widespread environmental prevalence of Benzophenone-3, coupled to its adverse impact on aquatic organisms, this characterisation provides an integral first step in better understanding the environmentally relevant degradation pathway of the commonly used UV filter. Given USK10’s ability to completely mineralise Benzophenone-3, it could prove to be a suitable candidate for bioremediation application.

In an attempt to discover and characterize the plethora of xenobiotic substances, this study investigates chemical compounds released into the environment with wastewater effluents. A novel non-targeted screening methodology based on ultra-high resolution Orbitrap mass spectrometry and nanoflow ultra-high performance liquid chromatography together with a newly optimized data-processing pipeline were applied to effluent samples from two state-of-the-art and one small wastewater treatment facility. In total, 785 molecular structures were obtained, of which 38 were identified as single compounds, while 480 structures were identified at a putative level. Most of these substances were therapeutics and drugs, present as parent compounds and metabolites. Using R packages Phyloseq and MetacodeR, originally developed for bioinformatics, significant differences in xenobiotic presence in the wastewater effluents between the three sites were demonstrated.

Abstract This study aims at discovering and characterizing the plethora of xenobiotic substances released into the environment with wastewater effluents. We present a novel non-targeted screening methodology based on ultra-high resolution Orbitrap mass spectrometry and nanoflow ultra-high performance liquid chromatography together with a new data-processing pipeline. This approach was applied to effluent samples from two state-of-the-art urban, and one small rural wastewater treatment facility. In total, 785 structures were obtained, of these 38 were identified as single compounds, while 480 structures were identified at a putative level. The vast majority of these were therapeutics and drugs, present as parent compounds and metabolites. Using the R packages Phyloseq and MetacodeR, we here present a novel way of visualizing LCMS data while showing significant difference in xenobiotic presence in the wastewater effluents between the three sites. 1. Significance We characterized a wide spectrum of xenobiotic substances using ultra-high performance liquid chromatography, and analysed the data with a new data-processing pipeline using microbial ecological tools to visualize and perform statistical testing of the chemical data to reveal trends in compound composition at the three WWTPs. This approach was applied to obtain and analyse data from effluent samples collected at three wastewater treatment facilities. In total, 785 chemical structures were achieved, with a majority identified as therapeutics and drugs. Several of the compounds are suspected endocrine disruptors. The data reveal a significant difference in compound diversity persisting in the wastewater effluents at the three sites. Our findings reveal the presence of undesirable compounds in effluent released into waterways, and address the greatest challenge in environmental chemistry – pinpointing single compounds of interest from masses of data produced.

Abstract The use of slowly degrading pesticides poses a particular problem when these are applied to urban areas such as gravel paths. The urban gravel provides an environment very different from agricultural soils; i.e., it is both lower in carbon and microbial activity. We, therefore, endeavoured to stimulate the degradation of the pesticide diflufenican added to an urban gravel microcosm amended with dry alfalfa to increase microbial activity. In the present study, the formation of the primary diflufenican metabolite 2-[3-(Trifluoromethyl)phenoxy]nicotinic acid (commonly abbreviated as AE-B) was stimulated by the alfalfa amendment. The concurrent changes of the active microbial communities within the gravel were explored using shotgun metatranscriptomic sequencing of ribosomal RNA and messenger RNA. Our results showed, that while the active microbial communities in the gravel were dominated by bacteria with a relative abundance of 87.0 – 98.5 %, the eukaryotic groups, fungi and micro-eukaryotes, both had a 4-5 fold increase in relative abundance over time in the alfalfa amended treatment. Specifically, the relative abundance of microorganisms involved in degradation of complex carbon sources, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Sordariomycetes, Mortierellales, and Tremellales, were shown to increase in the alfalfa amended treatment. Further, the functional gene profile showed an increase in genes involved in increased activity and production of new biomass in the alfalfa treatment compared to the control, as well as pointing to genes potentially involved in biodegradation of complex carbon sources and the biotransformation of diflufenican.