The ability to perturb genes in human cells is crucial for elucidating gene function and holds great potential for finding therapeutic targets for diseases such as cancer. To extend the catalog of human core and context-dependent fitness genes, we have developed a high-complexity second-generation genome-scale CRISPR-Cas9 gRNA library and applied it to fitness screens in five human cell lines. Using an improved Bayesian analytical approach, we consistently discover 5-fold more fitness genes than were previously observed. We present a list of 1,580 human core fitness genes and describe their general properties. Moreover, we demonstrate that context-dependent fitness genes accurately recapitulate pathway-specific genetic vulnerabilities induced by known oncogenes and reveal cell-type-specific dependencies for specific receptor tyrosine kinases, even in oncogenic KRAS backgrounds. Thus, rigorous identification of human cell line fitness genes using a high-complexity CRISPR-Cas9 library affords a high-resolution view of the genetic vulnerabilities of a cell.

Cis-regulatory elements (CREs) interact with trans regulators to orchestrate gene expression, but how transcriptional regulation is coordinated in multi-gene loci has not been experimentally defined. We sought to characterize the CREs controlling dynamic expression of the adjacent costimulatory genes CD28, CTLA4 and ICOS, encoding regulators of T cell-mediated immunity. Tiling CRISPR interference (CRISPRi) screens in primary human T cells, both conventional and regulatory subsets, uncovered gene-, cell subset- and stimulation-specific CREs. Integration with CRISPR knockout screens and assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-seq) profiling identified trans regulators influencing chromatin states at specific CRISPRi-responsive elements to control costimulatory gene expression. We then discovered a critical CCCTC-binding factor (CTCF) boundary that reinforces CRE interaction with CTLA4 while also preventing promiscuous activation of CD28. By systematically mapping CREs and associated trans regulators directly in primary human T cell subsets, this work overcomes longstanding experimental limitations to decode context-dependent gene regulatory programs in a complex, multi-gene locus critical to immune homeostasis.

Abstract The pathways that regulate cytokine responses in T cells are disrupted in autoimmunity, immune deficiencies, and cancer, and include immunotherapy targets. Systematic discovery of cytokine regulators requires both loss-of-function and gain-of-function studies, which have been challenging in primary human cells. We now have accomplished genome-wide pooled CRISPR activation (CRISPRa) and CRISPR interference (CRISPRi) screens in primary human T cells to map gene networks controlling Interleukin-2 and Interferon-γ production. Arrayed CRISPRa confirmed key hits and enabled multiplexed T cell secretome characterization, revealing reshaped cytokine responses driven by individual regulators. CRISPRa uncovered genes not canonically expressed in T cells, including the transcription factor FOXQ1, whose overexpression promoted the expression of most cytokines, while selectively dampening T helper 2 (Th2) cytokines. Paired CRISPRa and CRISPRi screens reveal signaling components that tune critical immune cell functions, which could inform design of future immunotherapies.

Summary Bromodomain (BRD)-containing proteins are chemically tractable multi-domain scaffolding molecules involved in acetyl lysine (Kac) signaling. BRD inhibitors have shown promise in clinical oncology, including melanomas; however, their narrow therapeutic windows and issues with resistance in pre-clinical models highlight the need to better understand the functions of and interconnection between BRD-containing proteins. Here, we use complementary interaction-mapping techniques (affinity purification and proximity-dependent biotinylation) to map the interactions of 39 of the 42 BRD-containing proteins and 110 additional proteins that physically or functionally associate with them. We uncover 3,892 novel interactions and reveal the intricate connectivity of the Kac machinery. Chemical inhibition of multiple BRD classes revealed that inhibiting BETs—but not mSWI/SNF or CREBBP/EP300 proteins—dramatically rewired the interactome. Finally, we identified MAPKAPK2 activity as a critical determinant of BET inhibitor sensitivity in melanoma through its impact on chromatin composition remodeling. In Brief Kougnassoukou Tchara et al . generate a static protein interaction map of the human acetyl lysine machinery by coupling two complementary functional proteomics approaches (FLAG affinity purification and proximity-dependent biotinylation) to mass spectrometry. They also investigate network changes upon bromodomain inhibition, and describe a novel resistance mechanism mediated by the p38 stress signaling pathway that causes significant metabolic changes. Highlights Two complementary interaction proteomics analyses of the human acetyl lysine machinery were performed. Novel target- and compound-specific impacts of bromodomain inhibitors were identified. MAPKAPK2 was identified as a novel resistance gene to BET bromodomain inhibitors in melanoma. BET bromodomain inhibition leads to metabolic adaptation in melanoma.

Summary: Successful glioblastoma (GBM) therapies have remained elusive due to limitations in understanding mechanisms of growth and survival of the tumorigenic population. Using CRISPR-Cas9 approaches in patient-derived GBM stem cells to interrogate function of the coding genome, we identify diverse actionable pathways responsible for growth that reveal the gene-essential circuitry of GBM stemness. In particular, we describe the Sox developmental transcription factor family; H3K79 methylation by DOT1L; and ufmylation stress responsiveness programs as essential for GBM stemness. Additionally, we find mechanisms of temozolomide resistance and sensitivity that could lead to combination strategies with this standard of care treatment. By reaching beyond static genome analysis of bulk tumors, with a genome wide functional approach, we dive deep into a broad range of biological processes to provide new understanding of GBM growth and treatment resistance. Significance: Glioblastoma (GBM) remains an incurable disease despite an increasingly thorough depth of knowledge of the genomic and epigenomic alterations of bulk tumors. Evidence from multiple approaches support that GBM reflects an aberrant developmental hierarchy, with GBM stem cells (GSCs), fueling tumor growth and invasion. The properties of this tumor subpopulation may also in part explain treatment resistance and disease recurrence. Unfortunately, we still have a limited knowledge of the molecular circuitry of these cells and progress has been slow as we have not been able, until recently, to interrogate function at the genome-wide scale. Here, using parallel genome-wide CRISPR-Cas9 screens, we identify the essential genes for GSC growth. Further, by screening in the presence of low and high dose temozolomide, we identify mechanisms of drug resistance and sensitivity. These functional screens in patient derived cells reveal new aspects of GBM biology and identify a diversity of actionable targets such as genes governing stem cell traits, epigenome regulation and the response to stress stimuli.

ABSTRACT Synucleinopathies are characterized by the accumulation and propagation of α-synuclein (α-syn) aggregates throughout the brain, leading to neuronal dysfunction and death. Understanding how these aggregates propagate from cell to cell in a prion-like fashion thus holds great therapeutic promises. Here, we focused on understanding the cellular processes involved in the entry and accumulation of pathological α-syn aggregates. We used an unbiased FACS-based genome-wide CRISPR/Cas9 knockout (KO) screening to identify genes that regulate the accumulation of α-syn preformed fibrils (PFFs) in cells. We identified key genes and pathways specifically implicated in α-syn PFFs intracellular accumulation, including heparan sulfate proteoglycans (HSPG) biosynthesis and Golgi trafficking. We show that all confirmed hits affect heparan sulfate (HS), a post-translational modification known to act as a receptor for proteinaceous aggregates including of α-syn and tau. Intriguingly, KO of SLC39A9 and C3orf58 genes, encoding respectively a Golgi-localized exporter of Zn 2+ , and the Golgi-localized putative kinase DIPK2A, specifically impaired the uptake of α-syn PFFs uptake but not of tau oligomers, by preventing the binding of PFFs to the cell surface. Mass spectrometry-based analysis of HS chains indicated major defects in HS maturation in SLC39A9 and C3orf58 KO cells, explaining the cell surface binding deficit. Our findings now clearly establish these two genes as HSPG-modulating factors. Interestingly, C3orf58 KO human iPSC-derived microglia exhibited a strong reduction in their ability to internalize α-syn PFFs. Altogether, our data establish HSPGs as major receptors for α-syn PFFs binding on the cell surface and identifies new players in α-syn PFFs cell surface binding and uptake.

CRISPR-Cas9 genome editing enables high-resolution detection of genetic vulnerabilities of cancer cells. We conducted a genome-wide CRISPR-Cas9 screen in RNF43 mutant pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cells, which rely on Wnt signaling for proliferation, and discovered a unique requirement for a WNT7B-FZD5 signaling circuit. Our results highlight an underappreciated level of functional specificity at the ligand-receptor level. We derived a panel of recombinant antibodies that reports the expression of nine out of ten human Frizzled receptors and confirm that WNT7B-FZD5 functional specificity cannot be explained by protein expression patterns. We developed two human antibodies that target FZD5 and robustly inhibited the growth of RNF43 mutant PDAC cells grown in vitro and as xenografts, providing strong orthogonal support for the functional specificity observed genetically. Proliferation of a patient-derived PDAC cell line harboring a RNF43 variant previously associated with PDAC was also selectively inhibited by the FZD5 antibodies, further demonstrating their use as a potential targeted therapy.

Dvl (Dishevelled) is one of several essential non-enzymatic components of the Wnt signaling pathway. In most current models, Dvl forms complexes with Wnt ligand receptors, Fzd and LRP5/6 at the plasma membrane, which then recruits other components of the destruction complex leading to the inactivation of β-catenin degradation. Although models such as this are widespread, direct evidence for this process is lacking. In this study, we tagged mEGFP to C-terminus of dishevlled2 gene using CRISPR/Cas9 induced homologous recombination and observed its dynamics directly at the single molecule level with Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. We focused on two questions: 1) What is the native size and the dynamic features of membrane-associated Dvl complexes during Wnt pathway activation? 2) What controls the behavior of these complexes? We found that membrane bound Dvl2 is predominantly monomer in the absent of Wnt (mean size 1.10). Wnt3a addition leads to an increase in the total concentration of membrane-bound Dvl2 from 0.08/μm2 to 0.34/μm2. Wnt3a also leads to increased oligomerization which raises the weighted averaged mean size of Dvl2 complexes to 1.4; with 65% of Dvl still as monomers. The driving force for Dvl2 oligomerization is the increased concentration of Dvl2 at the membrane caused by increased affinity of Dvl2 for Fzd, which is LRP5/6 independent. The oligomerized Dvl2 complexes have greatly increased dwell time, 2~3 minutes compared to less than 1 second for monomeric Dvl2. These properties make Dvl a unique scaffold dynamically changing its state of assembly and stability at the membrane in response to Wnt ligands.

The study of gene essentiality in human cells is crucial for elucidating gene function and holds great potential for finding therapeutic targets for diseases such as cancer. Technological advances in genome editing using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 systems have set the stage for identifying human cell line core and context-dependent essential genes. However, first generation negative selection screens using CRISPR technology demonstrate extreme variability across different cell lines. To advance the development of the catalogue of human core and context-dependent essential genes, we have developed an optimized, ultracomplex, genome-scale gRNA library of 176,500 guide RNAs targeting 17,661 genes and have applied it to negative and positive selection screens in a human cell line. Using an improved Bayesian analytical approach, we find CRISPR-based screens yield double to triple the number of essential genes than were previously observed using systematic RNA interference, including many genes at moderate expression levels that are largely refractory to RNAi methods. We further characterized four essential genes of unknown significance and found that they all likely exist in protein complexes with other essential genes. For example, RBM48 and ARMC7 are both essential nuclear proteins, strongly interact and are commonly amplified across major cancers. Our findings suggest the CRISPR-Cas9 system fundamentally alters the landscape for systematic reverse genetics in human cells for elucidating gene function, identifying disease genes, and uncovering therapeutic targets.

Abstract Glioblastoma stem cells (GSCs) exhibit latent neuronal lineage differentiation potential governed by the proneural transcription factor Achaete-scute homolog 1 (ASCL1) and harnessing and promoting terminal neuronal differentiation has been proposed as a novel therapeutic strategy. Here, using a genome-wide CRISPR suppressor screen we identified genes required for ASCL1-mediated neuronal differentiation. This approach revealed a specialized function of the Mediator complex tail module and of its subunits MED24 and MED25 for this process in GSCs, human fetal neural stem cells and pluripotent stem cells. We show that upon induction of neuronal differentiation MED25 is recruited to genomic loci co-occupied by ASCL1 to regulate neurogenic gene expression programs. MED24 and MED25 are sufficient to induce neuronal differentiation in GSC cultures and to mediate neuronal differentiation in multiple contexts. Collectively our data expand our understanding of the mechanisms underlying directed terminal neuronal differentiation in brain tumor stem cells and point to a unique function of the Mediator tail in neuronal reprogramming.