Bacterial toxins represent a vast reservoir of biochemical diversity that can be repurposed for biomedical applications. Such proteins include a group of predicted interbacterial toxins of the deaminase superfamily, members of which have found application in gene-editing techniques1,2. Because previously described cytidine deaminases operate on single-stranded nucleic acids3, their use in base editing requires the unwinding of double-stranded DNA (dsDNA)—for example by a CRISPR–Cas9 system. Base editing within mitochondrial DNA (mtDNA), however, has thus far been hindered by challenges associated with the delivery of guide RNA into the mitochondria4. As a consequence, manipulation of mtDNA to date has been limited to the targeted destruction of the mitochondrial genome by designer nucleases9,10.Here we describe an interbacterial toxin, which we name DddA, that catalyses the deamination of cytidines within dsDNA. We engineered split-DddA halves that are non-toxic and inactive until brought together on target DNA by adjacently bound programmable DNA-binding proteins. Fusions of the split-DddA halves, transcription activator-like effector array proteins, and a uracil glycosylase inhibitor resulted in RNA-free DddA-derived cytosine base editors (DdCBEs) that catalyse C•G-to-T•A conversions in human mtDNA with high target specificity and product purity. We used DdCBEs to model a disease-associated mtDNA mutation in human cells, resulting in changes in respiration rates and oxidative phosphorylation. CRISPR-free DdCBEs enable the precise manipulation of mtDNA, rather than the elimination of mtDNA copies that results from its cleavage by targeted nucleases, with broad implications for the study and potential treatment of mitochondrial disorders. An interbacterial toxin that catalyses the deamination of cytidines within double-stranded DNA forms part of a CRISPR-free, RNA-free base editing system that enables manipulation of human mitochondrial DNA.

Rationale: Previous work indicates that ivacaftor improves cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) activity and lung function in people with cystic fibrosis and G551D-CFTR mutations but does not reduce density of bacteria or markers of inflammation in the airway. These findings raise the possibility that infection and inflammation may progress independently of CFTR activity once cystic fibrosis lung disease is established.Objectives: To better understand the relationship between CFTR activity, airway microbiology and inflammation, and lung function in subjects with cystic fibrosis and chronic airway infections.Methods: We studied 12 subjects with G551D-CFTR mutations and chronic airway infections before and after ivacaftor. We measured lung function, sputum bacterial content, and inflammation, and obtained chest computed tomography scans.Measurements and Main Results: Ivacaftor produced rapid decreases in sputum Pseudomonas aeruginosa density that began within 48 hours and continued in the first year of treatment. However, no subject eradicated their infecting P. aeruginosa strain, and after the first year P. aeruginosa densities rebounded. Sputum total bacterial concentrations also decreased, but less than P. aeruginosa. Sputum inflammatory measures decreased significantly in the first week of treatment and continued to decline over 2 years. Computed tomography scans obtained before and 1 year after ivacaftor treatment revealed that ivacaftor decreased airway mucous plugging.Conclusions: Ivacaftor caused marked reductions in sputum P. aeruginosa density and airway inflammation and produced modest improvements in radiographic lung disease in subjects with G551D-CFTR mutations. However, P. aeruginosa airway infection persisted. Thus, measures that control infection may be required to realize the full benefits of CFTR-targeting treatments.

Bacterial lineages that chronically infect cystic fibrosis (CF) patients genetically diversify during infection. However, the mechanisms driving diversification are unknown. By dissecting ten CF lung pairs and studying ∼12,000 regional isolates, we were able to investigate whether clonally related Pseudomonas aeruginosa inhabiting different lung regions evolve independently and differ functionally. Phylogenetic analysis of genome sequences showed that regional isolation of P. aeruginosa drives divergent evolution. We investigated the consequences of regional evolution by studying isolates from mildly and severely diseased lung regions and found evolved differences in bacterial nutritional requirements, host defense and antibiotic resistance, and virulence due to hyperactivity of the type 3 secretion system. These findings suggest that bacterial intermixing is limited in CF lungs and that regional selective pressures may markedly differ. The findings also may explain how specialized bacterial variants arise during infection and raise the possibility that pathogen diversification occurs in other chronic infections characterized by spatially heterogeneous conditions.

Acinetobacter baumannii is a Gram-negative bacterial pathogen notorious for causing serious nosocomial infections that resist antibiotic therapy. Research to identify factors responsible for the pathogen's success has been limited by the resources available for genome-scale experimental studies. This report describes the development of several such resources for A. baumannii strain AB5075, a recently characterized wound isolate that is multidrug resistant and displays robust virulence in animal models. We report the completion and annotation of the genome sequence, the construction of a comprehensive ordered transposon mutant library, the extension of high-coverage transposon mutant pool sequencing (Tn-seq) to the strain, and the identification of the genes essential for growth on nutrient-rich agar. These resources should facilitate large-scale genetic analysis of virulence, resistance, and other clinically relevant traits that make A. baumannii a formidable public health threat.Acinetobacter baumannii is one of six bacterial pathogens primarily responsible for antibiotic-resistant infections that have become the scourge of health care facilities worldwide. Eliminating such infections requires a deeper understanding of the factors that enable the pathogen to persist in hospital environments, establish infections, and resist antibiotics. We present a set of resources that should accelerate genome-scale genetic characterization of these traits for a reference isolate of A. baumannii that is highly virulent and representative of current outbreak strains.

Abstract A hallmark of chronic bacterial infections is the long-term persistence of one or more pathogen species at the compromised site. Repeated detection of the same bacterial species can suggest that a single strain or lineage is continually present. However, infection with multiple strains of a given species, strain acquisition and loss, and changes in strain relative abundance can occur. Detecting strain-level changes and their effects on disease is challenging as most methods require labor intensive isolate-by-isolate analyses, thus, only a few cells from large infecting populations can be examined. Here we present a population-level method for enumerating and measuring the relative abundance of strains called “PopMLST”. The method exploits PCR amplification of strain-identifying polymorphic loci, next-generation sequencing to measure allelic variants, and informatic methods to determine whether variants arise from sequencing errors or low abundance strains. These features enable PopMLST to simultaneously interrogate hundreds of bacterial cells that are either cultured en masse from patient samples, or are present in DNA directly extracted from clinical specimens without ex vivo culture. This method could be used to detect epidemic or super-infecting strains, facilitate understanding of strain dynamics during chronic infections, and enable studies that link strain changes to clinical outcomes.

DNA–protein interactions (DPIs) are central to such fundamental cellular processes as transcription and chromosome maintenance and organization. The spatiotemporal dynamics of these interactions dictate their functional consequences; therefore, there is great interest in facile methods for defining the sites of DPI within cells. Here, we present a general method for mapping DPI sites in vivo using the double stranded DNA-specific cytosine deaminase toxin DddA. Our approach, which we term DddA-sequencing (3D-seq), entails generating a translational fusion of DddA to a DNA binding protein of interest, inactivating uracil DNA glycosylase, modulating DddA activity via its natural inhibitor protein, and DNA sequencing for genome-wide DPI detection. We successfully applied this method to three Pseudomonas aeruginosa transcription factors that represent divergent protein families and bind variable numbers of chromosomal locations. 3D-seq offers several advantages over existing technologies including ease of implementation and the possibility to measure DPIs at single-cell resolution.

Abstract Bacterial survival is fraught with antagonism, including that deriving from viruses and competing bacterial cells 1–3 4 . It is now appreciated that bacteria mount complex antiviral responses; however, whether a coordinated defense against bacterial threats is undertaken is not well understood. Previously we showed that Pseudomonas aeruginosa possess a danger sensing pathway that is a critical fitness determinant during competition against other bacteria 5, 6 . Here, we conducted genome-wide screens in P. aeruginosa that reveal three conserved and widespread interbacterial antagonism resistance clusters ( arc1-3 ). We find that although arc1-3 are coordinately activated by the Gac/Rsm danger sensing system, they function independently and provide idiosyncratic defense capabilities, distinguishing them from general stress response pathways. Our findings demonstrate that Arc3 family proteins provide specific protection against phospholipase toxins by preventing the accumulation of lysophospholipids in a manner distinct from previously characterized membrane repair systems. These findings liken the response of P. aeruginosa to bacterial threats to that of eukaryotic innate immunity, wherein threat detection leads to the activation of specialized defense systems.

While microbiome studies have focused on diversity on the species or higher level, bacterial species in microbiomes are represented by different, often multiple strains. These strains could be clonally and phenotypically very different, making assessment of strain content vital to a full understanding of microbiome function. This is especially important with respect to antibiotic resistant strains, the clonal spread of which may be dependent on competition between them and susceptible strains from the same species. The pandemic, multi-drug resistant, and highly pathogenic E. coli subclone ST131-H30 ( H 30) is of special interest, as it has already been found persisting in the gut and bladder of healthy people. In order to rapidly assess E. coli clonal diversity, we developed a novel method based on deep sequencing of two loci used for sequence typing, along with an algorithm for analysis of resulting data. Using this method, we assessed fecal and urinary samples from healthy women carrying H30, and were able to uncover considerable diversity, including strains with frequencies at <1% of the E. coli population. We also found that even in the absence of antibiotic use, H 30 could complete dominate the gut and, especially, urine of healthy carriers. Our study offers a novel tool for assessing a species' clonal diversity (clonobiome) within the microbiome, that could be useful in studying population structure and dynamics of multi-drug resistant and/or highly pathogenic strains in their natural environments.

Hard ticks of the order Ixodidae serve as vectors for numerous human pathogens, including the causative agent of Lyme Disease Borrelia burgdorferi. Tick-associated microbes can influence pathogen colonization, offering the potential to inhibit disease transmission through engineering of the tick microbiota. Here, we investigate whether B. burgdorferi encounters abundant bacteria within the midgut of wild adult Ixodes scapularis, its primary vector. Through the use of controlled sequencing methods and confocal microscopy, we find that the majority of field-collected adult I. scapularis harbor limited internal microbial communities that are dominated by endosymbionts. A minority of I. scapularis ticks harbor abundant midgut bacteria and lack B. burgdorferi. We find that the lack of a stable resident midgut microbiota is not restricted to I. scapularis since extension of our studies to I. pacificus, Amblyomma maculatum, and Dermacentor spp showed similar patterns. Finally, bioinformatic examination of the B. burgdorferi genome revealed the absence of genes encoding known interbacterial interaction pathways, a feature unique to the Borrelia genus within the phylum Spirochaetes. Our results suggest that reduced selective pressure from limited microbial populations within ticks may have facilitated the evolutionary loss of genes encoding interbacterial competition pathways from Borrelia.

Abstract When bacterial cells come in contact, antagonism mediated by the delivery of toxins frequently ensues. The potential for such encounters to have long-term beneficial consequences in recipient cells has not been investigated. Here we examined the effects of intoxication by DddA, a cytosine deaminase delivered via the type VI secretion system (T6SS) of Burkholderia cenocepacia . Despite its killing potential, we observed that several bacterial species resist DddA and instead accumulate mutations installed by the toxin, indicating that even in the absence of killing, interbacterial toxins can have profound consequences on target populations. Investigation of additional toxins from the deaminase superfamily revealed that mutagenic activity is a common feature of these proteins, including a representative we show targets single-stranded DNA and displays a markedly divergent structure. Our findings suggest that a surprising consequence of antagonistic interactions between bacteria could be the promotion of adaptation via the action of directly mutagenic toxins.