ABSTRACT High-throughput phenotyping is a modern technology to measure plant traits efficiently and in large scale by imaging systems over the whole growth season. Those images provide rich data for statistical analysis of plant phenotypes. We propose a pipeline to extract and analyze the plant traits for field phenotyping systems. The proposed pipeline include the following main steps: plant segmentation from field images, automatic calculation of plant traits from the segmented images, and functional curve fitting for the extracted traits. To deal with the challenging problem of plant segmentation for field images, we propose a novel approach on image pixel classification by transform domain neural network models, which utilizes plant pixels from greenhouse images to train a segmentation model for field images. Our results show the proposed procedure is able to accurately extract plant heights and is more stable than results from Amazon Turks, who manually measure plant heights from original images.

Cross-species comparisons of transcriptional regulation have the potential to identify functionally constrained transcriptional regulation and genes for which a change in transcriptional regulation correlates with a change in phenotype. Conventional differential gene expression analysis and a different approach based on identifying differentially regulated orthologs (DROs) are compared using paired time course gene expression data from two species which respond similarly to cold – maize (Zea mays) and sorghum (Sorghum bicolor). Both approaches suggest that, for genes conserved at syntenic positions for millions of years, the majority of cold responsive transcriptional regulation is species specific, although initial transcriptional responses to cold appear to be more conserved between the two species than later responses. In maize, the promoters of genes with both species specific and conserved transcriptional responses to cold tend to contain more micrococcal nuclease hypersensitive sites in their promoters, a proxy for open chromatin. However, genes with conserved patterns of transcriptional regulation between the two species show lower ratios of nonsynonymous to synonymous substitutions consistent with this population of genes experiencing stronger purifying selection. We hypothesize that cold responsive transcriptional regulation is a fast evolving and largely neutral molecular phenotype for the majority of genes in Andropogoneae, while a smaller core set of genes involved in perceiving and responding to cold stress are subject to functionally constrained cold responsive regulation.

ABSTRACT Chilling stress threatens plant growth and development, particularly affecting membrane fluidity and cellular integrity. Understanding plant membrane responses to chilling stress is important for unraveling the molecular mechanisms of stress tolerance. Whereas core transcriptional responses to chilling stress and stress tolerance are conserved across species, the associated changes in membrane lipids appear to be less conserved, as which lipids are affected by chilling stress varies by species. Here, we investigated changes in gene expression and membrane lipids in response to chilling stress during one diurnal cycle in sorghum ( Sorghum bicolor ), Urochloa (browntop signal grass, Urochloa fusca ) (lipids only), and foxtail millet ( Setaria italica ), leveraging their evolutionary relatedness and differing levels of chilling-stress tolerance. We show that most chilling-induced lipid changes are conserved across the three species, while we observed distinct, time-specific responses in chilling-tolerant foxtail millet, indicating the presence of a finely orchestrated adaptive mechanism. We detected diurnal rhythmicity in lipid responses to chilling stress in the three grasses, which were also present in Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana ), suggesting the conservation of rhythmic patterns across species and highlighting the importance of accounting for diurnal effects. When integrating lipid datasets with gene expression profiles, we identified potential candidate genes that showed corresponding transcriptional changes in response to chilling stress, providing insights into the differences in regulatory mechanisms between chilling-sensitive sorghum and chilling-tolerant foxtail millet. Significance Statement Plants respond to low-temperature stress in myriad ways. While core transcriptional changes are conserved across species, specific adaptive strategies do exist. However, membrane lipid responses during chilling do not appear to be conserved. Here, we collected samples from control and chilling stress–treated seedlings [PSC4] to assess gene expression and membrane lipids in three panicoid grasses to show that lipid metabolic changes follow a daily rhythm. Lipid changes in chilling-tolerant foxtail millet occurred at specific time points, partly explaining the difficulty in finding conserved chilling-induced lipid changes in previous reports. We identified specific orthologs in sorghum and foxtail millet that showed a correlation between gene expression and lipid metabolic changes; these orthologs may be used as potential target genes for developing chilling-tolerant sorghum varieties.

Maize (Zea mays ssp. mays) is one of three crops, along with rice and wheat, responsible for more than 1/2 of all calories consumed around the world. Increasing the yield and stress tolerance of these crops is essential to meet the growing need for food. The cost and speed of plant phenotyping is currently the largest constraint on plant breeding efforts. Datasets linking new types of high throughput phenotyping data collected from plants to the performance of the same genotypes under agronomic conditions across a wide range of environments are essential for developing new statistical approaches and computer vision based tools. A set of maize inbreds -- primarily recently off patent lines -- were phenotyped using a high throughput platform at University of Nebraska-Lincoln. These lines have been previously subjected to high density genotyping, and scored for a core set of 13 phenotypes in field trials across 13 North American states in two years by the Genomes to Fields consortium. A total of 485 GB of image data including RGB, hyperspectral, fluorescence and thermal infrared photos has been released. Correlations between image-based measurements and manual measurements demonstrated the feasibility of quantifying variation in plant architecture using image data. However, naive approaches to measuring traits such as biomass can introduce nonrandom measurement errors confounded with genotype variation. Analysis of hyperspectral image data demonstrated unique signatures from stem tissue. Integrating heritable phenotypes from high-throughput phenotyping data with field data from different environments can reveal previously unknown factors influencing yield plasticity.

Recent advances in automated plant phenotyping have enabled the collection time series measurements from the same plants of a wide range of traits over different developmental time scales. The availability of time series phenotypic datasets has increased interest in statistical approaches for comparing patterns of change between different plant genotypes and different treatment conditions. Two widely used methods of modeling growth over time are point-wise analysis of variance (ANOVA) and parametric sigmoidal curve fitting. Point-wise ANOVA yields discontinuous growth curves, which do not reflect the true dynamics of growth patterns in plants. In contrast, fitting a parametric model to a time series of observations does capture the trend of growth, however these models require assumptions regarding the true pattern of plant growth. Depending on the species, treatment regime, and subset of the plant lifecycle sampled this assumptions will not always hold true. Here we introduce a different approach -- functional ANOVA -- which yields continuous growth curves without requiring assumptions regarding patterns of plant growth. We compare and validate this approach using data from an experiment measuring growth of two maize (Zea mays ssp. mays) genotypes under two water availability treatments over a 21-day period. Functional ANOVA enables a nonparametric estimation of the dynamics of changes in plant traits over time without assumptions regarding curve shape. In addition to estimating smooth curves of trait values over time, functional ANOVA also estimates the the derivatives of these curves -- e.g. growth rates -- simultaneously. Using two different subsampling strategies, we demonstrate that this functional ANOVA method enables the comparison of growth curves between plants phenotyped on non-overlapping days with little reduction in estimation accuracy. This means functional ANOVA based approaches can allow larger numbers of samples and biological replicates to be scored in a single experiment given fixed amounts of phenotyping infrastructure and personnel.

Chilling stress threatens plant growth and development, particularly affecting membrane fluidity and cellular integrity. Understanding plant membrane responses to chilling stress is important for unraveling the molecular mechanisms of stress tolerance. Whereas core transcriptional responses to chilling stress and stress tolerance are conserved across species, the associated changes in membrane lipids appear to be less conserved, as which lipids are affected by chilling stress varies by species. Here, we investigated changes in gene expression and membrane lipids in response to chilling stress during one 24 hour cycle in chilling-tolerant foxtail millet (Setaria italica), and chilling-sensitive sorghum (Sorghum bicolor), and Urochloa (browntop signal grass, Urochloa fusca, lipids only), leveraging their evolutionary relatedness and differing levels of chilling-stress tolerance. We show that most chilling-induced lipid changes are conserved across the three species, while we observed distinct, time-specific responses in chilling-tolerant foxtail millet, indicating the presence of a finely orchestrated adaptive mechanism. We detected rhythmicity in lipid responses to chilling stress in the three grasses, which were also present in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), suggesting the conservation of rhythmic patterns across species and highlighting the importance of accounting for time of day. When integrating lipid datasets with gene expression profiles, we identified potential candidate genes that showed corresponding transcriptional changes in response to chilling stress, providing insights into the differences in regulatory mechanisms between chilling-sensitive sorghum and chilling-tolerant foxtail millet.

In many eukaryotic species the organismal functions of only a small fraction of annotated genes are supported by individual genetic characterization. The organismal functions of a somewhat larger, but still strict minority, of gene models are supported by quantitative genetic analyses (e.g. GWAS). However the organismal functions of the vast majority of gene models are not supported by any direct evidence. Genes characterized by direct investigation exhibit a set of molecular, structural, population genetic, and evolutionary features which distinguish these genes from other gene models. Weaker versions of the same signatures are present among genes identified through conventional quantitative genetics approaches. A new multi-trait multi-SNP association test, the Genome-Phenome Wide Association Study (GPWAS) combines data from large sets of traits and dense resequencing data to identify that set of genes significantly associated with phenotypic variation per se . Genes identified using GPWAS and data for 260 phenotypic traits scored across a maize ( Zea mays ) exhibit many of the same molecular, structural, population genetic, and evolutionary signals indicative of genes with functions characterized by direct genetic investigation. The strength of these signals is significantly higher for genes identified using GPWAS than genes identified through conventional GWAS. These results were consistent with a large subset of annotated gene models in maize play little or no role in determining organismal phenotypes. GPWAS and future similar analytical approaches that leverage data from multiple correlated and uncorrelated traits across the same population may provide a method to prioritize those genes most involved in regulation phenotypic variation across diverse species.