Rapid perturbation of protein function permits the ability to define primary molecular responses while avoiding down-stream cumulative effects of protein dysregulation. The auxin-inducible degron (AID) system was developed as a tool to achieve rapid and inducible protein degradation in non-plant systems. However, tagging proteins at their endogenous loci results in chronic, auxin-independent degradation by the proteasome. To correct this deficiency, we expressed the Auxin Response Transcription Factor (ARF) in an improved inducible degron system. ARF is absent from previously engineered AID systems, but ARF is a critical component of native auxin signaling. In plants, ARF directly interacts with AID in the absence of auxin and we found that expression of the ARF Phox and Bem1 (PB1) domain suppresses constitutive degradation of AID-tagged proteins. Moreover, the rate of auxin-induced AID degradation is substantially faster in the ARF-AID system. To test the ARF-AID system in a quantitative and sensitive manner, we measured genome-wide changes in nascent transcription after rapidly depleting the ZNF143 transcription factor. Transciptional profiling indicates that ZNF143 activates transcription in cis and ZNF143 regulates promoter-proximal paused RNA Polymerase density. Rapidly inducible degradation systems that preserve the target protein’s native expression levels and patterns will revolutionize the study of biological systems by enabling specific and temporally defined protein dysregulation.

Abstract Coupling molecular biology to high throughput sequencing has revolutionized the study of biology. Molecular genomics techniques are continually refined to provide higher resolution mapping of nucleic acid interactions and structure. Sequence preferences of enzymes can interfere with the accurate interpretation of these data. We developed seqOutBias to characterize enzymatic sequence bias from experimental data and scale individual sequence reads to correct intrinsic enzymatic sequence biases. SeqOutBias efficiently corrects DNase-seq, TACh-seq, ATAC-seq, MNase-seq, and PRO-seq data. We show that seqOutBias correction facilitates identification of true molecular signatures resulting from transcription factors and RNA polymerase interacting with DNA.

Coronary artery disease (CAD) is the leading cause of death in the United States. There is a need for novel therapeutic targets that prevent life-threatening consequences directly associated with plaque accumulation in the vascular wall—the underlying cause of CAD. During the progression of atherosclerosis, vascular smooth muscle cells (VSMCs) transdifferentiate from a contractile to a synthetic phenotype that can either promote fibrous cap stability (fibroblast-like) or contribute to inflammation and plaque accumulation (macrophage or osteoblast-like).The molecular mechanisms driving the functional phenotypic switching of VSMCs are not fully understood and represent a unique opportunity for discovering new treatments directly targeting plaque formation in the vascular wall. We measured gene expression regulation during VSMC dedifferentiation using time-course chromatin remodeling (ATACseq) and nascent transcription data (PROseq). We stimulated VSMCs from three healthy heart transplant donors with PDGF-BB for 0, 4, 8, 12, and 16 hours and performed sequencing in duplicate for each donor at each time point for a total of 30 PROseq and 30 ATACseq libraries. We identified 231,315 regions of accessible chromatin (peaks) in the ATACseq data and 12,954 genes in the PROseq data across the five time points. Likelihood ratio testing detected 13,285 peaks and 7,438 genes with time-dynamic changes in read counts representing six patterns of variable accessibility and nascent transcription following PDGF-BB stimulation: gradual increase/decrease (I/D), immediate I/D, and transient I/D. Transcription factor binding site (TFBS) motif enrichment of dynamic peaks revealed 31 TFs unique to one time dynamic. We identified 157 genes directly downstream of peaks enriched for the 31 TFBSs sharing similar time-specific fold changes. THAP1 binding site motifs had the highest number of cis-regulatory connections (596) and downstream genes (80). Our results capture the first ever time-course ATACseq and PROseq analysis conducted in human VSMCs and provide the ability to predict regulatory edges between TFs and genes in order to map the regulatory cascading events occurring during VSMC switching from a contractile to a synthetic state.

Nascent transcript measurements derived from run-on sequencing experiments are critical for the investigation of transcriptional mechanisms and regulatory networks. However, conventional gene annotations specify the boundaries of mRNAs, which significantly differ from the boundaries of primary transcripts. Moreover, transcript isoforms with distinct transcription start and end coordinates can vary between cell types. Therefore, new primary transcript annotations are needed to accurately interpret run-on data. We developed the primaryTranscriptAnnotation R package to infer the transcriptional start and termination sites of annotated genes from genomic run-on data. We then used these inferred coordinates to annotate transcriptional units identified de novo. Hence, this package provides the novel utility to integrate data- driven primary transcript annotations with transcriptional unit coordinates identified in an unbiased manner. Our analyses demonstrated that this new methodology increases the sensitivity for detecting differentially expressed transcripts and provides more accurate quantification of RNA polymerase pause indices, consistent with the importance of using accurate primary transcript coordinates for interpreting genomic nascent transcription data.