SUMMARY Broadly HIV-1 neutralizing VRC01-class antibodies bind the CD4-binding site of the HIV-1 envelope (Env) and contain VH1-2*02-derived heavy chains paired with light chains expressing five amino acid long CDRL3s. Their unmutated forms do not recognize Env or neutralize HIV-1. The lack of elicitation of VRC01-class antibodies in human clinical trials could potentially be due to the absence of activation of the corresponding naïve B cells by the vaccine Env immunogens. To address this point directly, we examined Env-specific BCR sequences from participants in the HVTN 100 clinical trial. Of all the sequences analyzed only one displayed sequence homology to VRC01-class antibodies, but the corresponding antibody (FH1) recognized the C1C2 gp120 domain. For FH1 to switch epitope recognition to the CD4-binding site, alterations in both the CDRH3 and CDRL3 were necessary. Our findings support the use of specifically designed immunogens to activate VRC01-class B cells in future human vaccine trials.

The discovery that humans can produce potent broadly neutralizing antibodies (bNAbs) to several different epitopes on the HIV-1 spike has reinvigorated efforts to develop an antibody based HIV-1 vaccine. Antibody cloning from single cells revealed that nearly all bNAbs show unusual features that could help explain why it has not been possible to elicit them by traditional vaccination, and instead that it would require a sequence of different immunogens. This idea is supported by experiments with genetically modified immunoglobulin knock-in mice. Sequential immunization with a series of specifically designed immunogens was required to shepherd the development of bNAbs. However, knock-in mice contain super-physiologic numbers of bNAb precursor expressing B cells and therefore how these results can be translated to a more physiologic setting remains to be determined. Here we make use of adoptive transfer experiments using knock-in B cells that carry a synthetic intermediate in the pathway to anti-HIV-1 bNAb development to examine how the relationship between B cell receptor affinity and precursor frequency affects germinal center B cell recrutiment and clonal expansion. Immunization with soluble HIV-1 antigens can recruit bNAb precursor B cells to the germinal center when there are as few as 10 such cells per mouse. However, at low precursor frequencies the extent of clonal expansion is directly proportional to the affinity of the antigen for the B cell receptor, and recruitment to germinal centers is variable and dependent on re-circulation.

ABSTRACT The study of antigen-specific lymphocytes has been a key advancement in immunology the past few decades. The development of multimerized probes containing antigens, peptide:MHC complexes, or other ligands was one innovation allowing the direct study antigen-specific lymphocytes by flow cytometry. While these types of studies are now common and performed by thousands of laboratories, quality control and assessment of probe quality is often minimal. In fact, many of these types of probes are made in-house and protocols vary between labs. While peptide:MHC multimers can often be obtained from commercial sources or core facilities, few such services exist for antigen multimers. To ensure high quality and consistency with ligand probes, we have developed an easy and robust multiplexed approach using commercially available beads able to bind antibodies specific for the ligand of interest. Using this assay, we have sensitively assessed the performance of peptide:MHC and antigen tetramers and find considerable batch-to-batch variability in performance and stability over time. This assay can also reveal common production errors such as miscalculation of antigen concentration. Unexpectedly, probes including the fluorochrome allophycocyanin exhibited more rapid performance decline compared to probes including the fluorochrome R-phycoerythrin when both were stored at 4°C. This performance decline was reduced for most, but not all, batches when antigen tetramers were instead stored at −20°C in 50% glycerol. This work could set the stage for the development of standardized assays for all commonly used ligand probes to limit lab-to-lab technical variation, and experimental failure due to probe underperformance.

ABSTRACT Once naïve B cells expressing germline VRC01-class B cell receptors become activated by germline-targeting immunogens, they enter germinal centers and undergo affinity maturation. Booster immunizations with heterologous Envs are required for the full maturation of VRC01-class antibodies. Here, we examined whether and how three adjuvants, Poly(I:C), GLA-LSQ, or Rehydragel, that activate different pathways of the innate immune system, influence the rate and type of somatic mutations accumulated by VRC01-class BCRs that become activated by the germline-targeting 426c.Mod.Core immunogen and the heterologous HxB2.WT.Core booster immunogen. We report that although the adjuvant used had no influence on the durability of plasma antibody responses after the prime, it influenced the plasma VRC01 antibody titers after the boost and the accumulation of somatic mutations on the elicited VRC01 antibodies. ONE SENTENCE SUMMARY VRC01-class BCRs with different somatic mutations are being selected depending on the adjuvant used during immunization

ABSTRACT Respiratory syncytial virus (RSV), human metapneumovirus (HMPV), and human parainfluenza virus types one (HPIV1) and three (HPIV3) are a major cause of death, morbidity, and health care costs worldwide, and they can exact a significant toll on immunocompromised patients, the elderly, and those with underlying lung disease. There is an unmet medical need for safe and effective medications for many of the viruses responsible for common respiratory viral infections in vulnerable patient populations. While a protective monoclonal antibody exists for RSV, clinical use is limited to high-risk infant populations. Here, we present the discovery, in vitro characterization, and in vivo efficacy testing of two cross-neutralizing monoclonal antibodies, one targeting both HPIV3 and HPIV1 and the other targeting both RSV and HMPV. The 3×1 antibody is capable of targeting multiple parainfluenza viruses; the MxR antibody shares features with other previously reported monoclonal antibodies that are capable of neutralizing both RSV and HMPV. We obtained structures using cryo-electron microscopy of these antibodies in complex with their antigens to 3.62 Å resolution for 3×1:HPIV3 and to 2.24 Å for MxR:RSV, providing a structural basis to corroborate our in vitro characterization of binding and neutralization. Together, a cocktail of 3×1 and MxR could have clinical utility in providing broad protection against four of the respiratory viruses that cause significant morbidity and mortality in at-risk individuals.