The majority of studies of genetic association with disease have been performed in Europeans. This European bias has important implications for risk prediction of diseases across global populations. In this commentary, we justify the need to study more diverse populations using both empirical examples and theoretical reasoning. The majority of studies of genetic association with disease have been performed in Europeans. This European bias has important implications for risk prediction of diseases across global populations. In this commentary, we justify the need to study more diverse populations using both empirical examples and theoretical reasoning. It has been well documented that genetic studies of human disease, especially large-scale ones, have not captured the level of diversity that exists globally, as they are predominantly based on populations of European ancestry (Popejoy and Fullerton, 2016Popejoy A.B. Fullerton S.M. Genomics is failing on diversity.Nature. 2016; 538: 161-164Crossref PubMed Scopus (806) Google Scholar). The under-representation of ethnically diverse populations impedes our ability to fully understand the genetic architecture of human disease and exacerbates health inequalities. Further, the lack of ethnic diversity in human genomic studies means that our ability to translate genetic research into clinical practice or public health policy may be dangerously incomplete, or worse, mistaken. For example, attempts to use estimates of genetic risk from European-based studies in non-Europeans may result in inaccurate assessment of risk and lack of interventions in under-studied populations. In this commentary, we discuss examples that illustrate why inclusion of ethnically diverse populations in human genetic studies facilitates identification of genetic risk factors for Mendelian and complex diseases. Additionally, we discuss why lack of replication across populations of genetic associations with complex traits, including disease risk, is expected based on the evolutionary history of populations across the globe. Lastly, we discuss challenges and future directions for promoting equity in human genomic studies. For Mendelian diseases, a pathogenic variant usually causes disease regardless of the population in which it occurs (Figure 1A). However, in some cases, such as X-linked G6PD deficiency and favism, a condition will only present upon specific environmental exposure (i.e., fava bean consumption causing hemolytic anemia). Given diverse evolutionary histories, different mutations in the same gene may account for a given disease in diverse populations (allelic heterogeneity). Variation in causative mutations may confound diagnoses or treatments. Cystic fibrosis (CF) is a Mendelian disease common in Europe (1 in 2000–3000 births) and rarer in African Americans (1 in 17,000 births). A consequence of low CF prevalence in African-descent individuals is that CF is often underdiagnosed. In Europeans, the most common causative allele is ΔF508 in the CFTR gene, accounting for more than 70% of cases. However, ΔF508 accounts for only about 29% of CF cases in people of the African diaspora (Stewart and Pepper, 2017Stewart C. Pepper M.S. Cystic Fibrosis in the African Diaspora.Ann. Am. Thorac. Soc. 2017; 14: 1-7Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar). In contrast, a different mutation 3120+1G→A accounts for between 15% and 65% of CF patients in South Africans with African ancestry (Padoa et al., 1999Padoa C. Goldman A. Jenkins T. Ramsay M. Cystic fibrosis carrier frequencies in populations of African origin.J. Med. Genet. 1999; 36: 41-44PubMed Google Scholar). Indeed, more than 2,000 rare mutations in CFTR underlie considerable clinical heterogeneity and guide different treatment modalities. Such is the case for the CF medication ivacaftor that selectively targets mutations affecting the receptor gating capacity of the CFTR protein. Knowing and testing for specific pathogenic variants that vary in frequency across populations is crucial for appropriate clinical intervention. There may also be population-specific mutations in understudied populations that cause health disparities. For example, transthyretin (TTR) amyloid cardiomyopathy (ATTR-CM), due to a mutant transthyretin protein producing accumulation of amyloid fibrils, is an important and underdiagnosed cause of heart failure (HF) in African Americans. A TTR pathogenic missense mutation (V122I) is almost exclusively found in African descent subjects, with a carrier frequency in African Americans of 3%–4%. V122I acts in a dominant manner and accounts for as much as 10% of all HF cases in African Americans (Buxbaum et al., 2006Buxbaum J. Jacobson D.R. Tagoe C. Alexander A. Kitzman D.W. Greenberg B. Thaneemit-Chen S. Lavori P. Transthyretin V122I in African Americans with congestive heart failure.J. Am. Coll. Cardiol. 2006; 47: 1724-1725Crossref PubMed Scopus (53) Google Scholar). As new treatments targeting TTR gene expression or stabilizing the abnormal transthyretin are becoming available, genetic screening for this prevalent mutation in people of African descent can provide critical information with respect to both diagnostic accuracy and therapy, a case in point for precision medicine. Identifying pathogenic variants causing Mendelian disease is more complicated when one considers locus heterogeneity. For example, there are more than 300 genes involved in retinal disease; over 3000 mutations in 65 genes cause retinitis pigmentosa (RP) with different modes of inheritance (https://sph.uth.edu/retnet/). As many of these mutations have only been characterized in Europeans, we know little about the genetic causes of retinal disease across ethnically diverse populations. Genetic modifiers can also complicate the understanding of the biology underlying differences in disease presentation. Sickle cell disease (SCD), which is caused by homozygosity for a missense mutation (Glu6Val) in the β-globin gene (HBB), is an example. Every year about 300,000 newborns are diagnosed with SCD, and the SCD mortality in Africa among children less than 5 years old can reach 90%. Despite the high mortality of homozygotes, this mutation is maintained at high frequency in malaria endemic regions of Africa because heterozygous individuals are protected from malaria, resulting in balancing selection. Modifiers of SCD severity include maintenance of high fetal hemoglobin (HbF) expression, normally completely lost by 12 months of age, which results in fewer sickling crises and less severe disease. In Saudi patients with the Benin haplotype, HbF expression persists in adults, reaching twice the levels observed in African patients with the same haplotype (Piel et al., 2017Piel F.B. Steinberg M.H. Rees D.C. Sickle Cell Disease.N. Engl. J. Med. 2017; 376: 1561-1573Crossref PubMed Scopus (566) Google Scholar), and other genes can also modify the expression of HbF. Further, distinct traits can modify SCD presentation, including alpha-thalassemia, the prevalence and allelic spectrum of which varies across populations (Piel et al., 2017Piel F.B. Steinberg M.H. Rees D.C. Sickle Cell Disease.N. Engl. J. Med. 2017; 376: 1561-1573Crossref PubMed Scopus (566) Google Scholar). Hence, presentation of SCD may vary among populations due to gene-gene interactions (epistasis). The reason for phenotypic differences among populations with respect to SCD disease modifiers remains largely unexplained, despite clear clinical relevance. Larger studies across diverse populations of genetic factors influencing SCD presentation are needed. As whole-genome sequencing (WGS) is increasingly used to infer the causes of rare undiagnosed diseases, reference genomes from more ethnically diverse populations are particularly important. This is because one criterion for identifying putative causal variants is by confirming rarity across populations. Therefore, if databases do not include sufficient data from ethnically diverse populations we may mistakenly infer that a benign variant is pathogenic. For example, the gnomAD exome and genome database includes ∼60% European sequences and less than 10% sequences from individuals of African ancestry at present (https://macarthurlab.org/2017/02/27/the-genome-aggregation-database-gnomad/). As of 2018, the majority of genome-wide association studies (GWAS), which aim to identify genetic variants associated with complex traits including disease risk, have been conducted in European (52%) or Asian (21%) populations (Figure 2, left). When we consider the number of individuals included in GWAS based on ethnicity, 78% are European, 10% are Asian, 2% are African, 1% are Hispanic, and all other ethnicities represent < 1% of GWAS (Figure 2, right). These disparities are unacceptable, particularly since GWAS findings may not replicate across ethnic groups. The ability to replicate genetic associations across diverse populations can be affected by several factors. Differences in linkage disequilibrium (LD) across ethnicities influences how well causal variants are captured by tagging SNPs identified in a single population (Figure 1B). Markers in LD with risk variants in Europeans may not be in LD in other populations because LD patterns reflect different demographic histories that vary globally. Modern humans originated in Africa within the past 300,000 years and migrated out of Africa within the past 80,000 years. Africans have maintained larger and more sub-structured populations resulting in diverse patterns of LD across the continent (Tishkoff et al., 2009Tishkoff S.A. Reed F.A. Friedlaender F.R. Ehret C. Ranciaro A. Froment A. Hirbo J.B. Awomoyi A.A. Bodo J.M. Doumbo O. et al.The genetic structure and history of Africans and African Americans.Science. 2009; 324: 1035-1044Crossref PubMed Scopus (1056) Google Scholar). In contrast, the migration out of Africa resulted in a population bottleneck followed by a series of founding events as modern humans spread across the globe. Thus, non-Africans have more extended regions of LD, the precise structure of which is determined by their population histories (Figure 1B). These differences in LD among populations can make trans-ethnic mapping particularly informative for identifying risk variants. The lack of replication of GWAS among populations could also be due to differences in genetic architecture. Differences in genetic architecture among ethnically diverse groups could be due to population specific variation as well as changes in allele frequency that arise as a product of genetic drift, local selection, or both. For example, founder populations can have differences in prevalence of a complex disease, or related intermediate phenotypes, compared to the source population and may be particularly informative for complex disease mapping. In the Finnish population that underwent founder events, there are many low-frequency loss-of-function variants that associate with complex phenotypes, including lipid levels (Lim et al., 2014Lim E.T. Würtz P. Havulinna A.S. Palta P. Tukiainen T. Rehnström K. Esko T. Mägi R. Inouye M. Lappalainen T. et al.Sequencing Initiative Suomi (SISu) ProjectDistribution and medical impact of loss-of-function variants in the Finnish founder population.PLoS Genet. 2014; 10: e1004494Crossref PubMed Scopus (249) Google Scholar). Variation in phenotypic prevalence for complex diseases can also be found in Ashkenazim, French Canadians, Icelanders, and Sardinians—populations that experienced founder effects. However, differentiating between the effects of selection and drift on genetic diversity in these populations, not always mutually exclusive, needs to be resolved on a case by case basis. In small, bottlenecked populations or those practicing consanguineous mating, homozygosity is enriched. Homozygosity mapping in such populations has long been a successful strategy to locate recessive disease genes. More recently, the identification of rare homozygous loss-of-function mutations due to consanguinity in apparently healthy individuals has provided important insights into gene function and has paved the way to the discovery or validation of drug targets, as in the Human Knockout Project that focuses on Pakistanis (Saleheen et al., 2017Saleheen D. Natarajan P. Armean I.M. Zhao W. Rasheed A. Khetarpal S.A. Won H.H. Karczewski K.J. O’Donnell-Luria A.H. Samocha K.E. et al.Human knockouts and phenotypic analysis in a cohort with a high rate of consanguinity.Nature. 2017; 544: 235-239Crossref PubMed Scopus (191) Google Scholar). Loss-of-function variants can also shed light on biological pathways that have relevance across populations, as has been the case with the discovery of PCSK9, an important gene for regulating LDL levels. This discovery was facilitated by studying people of African descent with PCSK9 nonsense mutations, but the knowledge has translated into a drug with global utility. Beneficial loss of function mutations are promising targets for treatment, as it is easier to develop therapeutics that turn gene products off rather than on. Local adaptation can also influence the genetic architecture of complex traits, which may not necessarily be related to the initial selection event(s), as many genes have pleiotropic effects. For example, in African Americans with non-diabetic progressive chronic and end stage kidney disease, two African-specific risk variants (G1 and G2) in the apolipoprotein L1 gene (APOL1) are strongly associated with these conditions. These variants confer an increased risk of approximately 7- to 10-fold for kidney disease, and, together, partially explain the higher incidence of end stage renal disease in African Americans as compared to European Americans (Freedman et al., 2018Freedman B.I. Limou S. Ma L. Kopp J.B. APOL1-Associated Nephropathy: A Key Contributor to Racial Disparities in CKD.Am. J. Kidney Dis. 2018; 72: S8-S16Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (77) Google Scholar, Genovese et al., 2010Genovese G. Friedman D.J. Ross M.D. Lecordier L. Uzureau P. Freedman B.I. Bowden D.W. Langefeld C.D. Oleksyk T.K. Uscinski Knob A.L. et al.Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans.Science. 2010; 329: 841-845Crossref PubMed Scopus (1402) Google Scholar). It has been argued that these variants are at high frequency in populations of West African descent because they are protective against sleeping sickness caused by Trypanosoma brucei protozoa. These same variants at APOL1 are also associated with a broad range of nondiabetic kidney diseases, including severe lupus nephritis and sickle cell nephropathy (Freedman et al., 2018Freedman B.I. Limou S. Ma L. Kopp J.B. APOL1-Associated Nephropathy: A Key Contributor to Racial Disparities in CKD.Am. J. Kidney Dis. 2018; 72: S8-S16Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (77) Google Scholar). Another potential complication causing lack of replication of GWAS across ethnic groups could be epistasis due to differences in genetic backgrounds (G × G) as well as gene-environment (G × E) interactions that vary among populations. A recent multi-ethnic, genome-wide study identified genetic loci interacting with physical activity to affect blood lipid levels, illustrating G × E interactions and the value of including different ancestries in studies of complex traits. Variants in four loci were found to interact with physical activity to influence lipid levels. These interactions were discovered in a trans-ethnic mapping study that included European, African, Asian, and Hispanic populations. Two out of the four loci (SNTA1 and CNTNAP2) were identified because Africans and Hispanics showed a relatively high frequency of the variants associated with lipid levels compared to other populations (Kilpeläinen et al., 2019Kilpeläinen T.O. Bentley A.R. Noordam R. Sung Y.J. Schwander K. Winkler T.W. Jakupović H. Chasman D.I. Manning A. Ntalla I. et al.Lifelines Cohort StudyMulti-ancestry study of blood lipid levels identifies four loci interacting with physical activity.Nat. Commun. 2019; 10: 376Crossref PubMed Scopus (46) Google Scholar). Had the study only been performed in Europeans, these effects would not have been discovered. Even when diverse populations are studied, specific gene effects in these populations may not be evident, as often diverse populations are studied only as part of large meta-analyses that estimate associations from combined data. The result of this analytical strategy is to identify variants that have mostly similar effects across populations, but it can reduce the ability to detect population-specific genetic risk factors. Although studies that perform meta-analyses clearly discover true risk variants, they often fail to identify those variants that differ in frequency among populations, thereby missing an unknown proportion of the genetic risk. Polygenic risk scores (PRS) are obtained by computing the effect size of thousands of genetic variants from a discovery sample, then combining and applying them to the genetic profiles from other individuals to predict risk of complex disease. It has been recently claimed that PRS can attain cumulative effect sizes comparable to monogenic diseases. PRS have been used to assess European individuals at high genetic risk (odds ratio > 3) for polygenic diseases such as coronary artery disease (8% of the population) and Type 2 diabetes (3.4% of the population) (Khera et al., 2018Khera A.V. Chaffin M. Aragam K.G. Haas M.E. Roselli C. Choi S.H. Natarajan P. Lander E.S. Lubitz S.A. Ellinor P.T. Kathiresan S. Genome-wide polygenic scores for common diseases identify individuals with risk equivalent to monogenic mutations.Nat. Genet. 2018; 50: 1219-1224Crossref PubMed Scopus (1257) Google Scholar). For the reasons discussed above for complex disease (e.g., differences in LD and heterogeneity), PRS may not be transferable across diverse populations. Indeed, inconsistencies in the directions of effect of risk variants have been observed across ethnic groups (Martin et al., 2017Martin A.R. Gignoux C.R. Walters R.K. Wojcik G.L. Neale B.M. Gravel S. Daly M.J. Bustamante C.D. Kenny E.E. Human Demographic History Impacts Genetic Risk Prediction across Diverse Populations.Am. J. Hum. Genet. 2017; 100: 635-649Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (598) Google Scholar). In general, these limitations on transferability of PRS will underestimate or overestimate disease risk in understudied populations. For instance, a UK study of PRS for schizophrenia showed a 10-fold higher score in Africans and African-Americans than in Europeans, but this does not reflect true disease risk, indicating that the PRS was not informative across populations (Curtis, 2018Curtis D. Polygenic risk score for schizophrenia is more strongly associated with ancestry than with schizophrenia.Psychiatr. Genet. 2018; 28: 85-89Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar). Thus, there is an urgent need to determine the accuracy of PRS replicability before this approach is implemented in the clinic. Genetic variation among populations can affect how efficacious a drug is or how likely it is to cause adverse events. For example, warfarin, the most prescribed oral anticoagulant worldwide, has a narrow therapeutic range, and dose requirements vary considerably between patients, posing a treatment challenge. Inter-individual variation in dosage effects is influenced by single nucleotide polymorphisms (SNPs) in CYP2C9, VKORC1, CYP4F2, and another variant near the CYP2C gene cluster. Algorithms incorporating genotype information exist (although not widely implemented), to administer the most appropriate warfarin dosage. Studies have shown that in Europeans the proportion of variance in drug metabolism explained by SNPs in the CYP2C9, VKORC1, and CYP4F2 genes is 18%, 30%, and 11%, respectively (Johnson et al., 2017Johnson J.A. Caudle K.E. Gong L. Whirl-Carrillo M. Stein C.M. Scott S.A. Lee M.T. Gage B.F. Kimmel S.E. Perera M.A. et al.Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium (CPIC) Guideline for Pharmacogenetics-Guided Warfarin Dosing: 2017 Update.Clin. Pharmacol. Ther. 2017; 102: 397-404Crossref PubMed Scopus (349) Google Scholar); however, in patients of African descent these variants explain much less of the differences in drug metabolism. Hence, the algorithms derived from Europeans do not translate into better and safer treatment across ethnic groups. Identification of genetic variants that influence drug metabolism across global populations is needed to accurately predict drug response in individuals of diverse ethnicities. G6PD deficiency is another important example of how genetic variation can affect drug safety. Individuals who are enzyme deficient are at risk of hemolysis due to several drugs, including some used to treat malaria, e.g., primaquine. Neglecting genetic differences among populations has consequences, most importantly for those subjects who are at risk of serious side effects. In 2008, a failure to properly take into account deficiency-causing mutations in sub-Saharan Africa (where G6PD deficiency can reach a frequency of 25% due to protection against malaria infection) led to the withdrawal of an effective antimalarial drug combination (chlorproguanil-dapsone), present on the market since 2003. This happened even though the combination could have been safely used in G6PD non-enzymatically deficient individuals (Luzzatto, 2010Luzzatto L. The rise and fall of the antimalarial Lapdap: a lesson in pharmacogenetics.Lancet. 2010; 376: 739-741Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (54) Google Scholar). A recent WGS study of bronchodilator drug response (BDR) to albuterol in 1,440 children with asthma discovered associations with variants near or within plausible candidate genes (Mak et al., 2018Mak A.C.Y. White M.J. Eckalbar W.L. Szpiech Z.A. Oh S.S. Pino-Yanes M. Hu D. Goddard P. Huntsman S. Galanter J. et al.NHLBI Trans-Omics for Precision Medicine (TOPMed) ConsortiumWhole-Genome Sequencing of Pharmacogenetic Drug Response in Racially Diverse Children with Asthma.Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2018; 197: 1552-1564Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar). Samples were selected from patients who were low and high responders to albuterol, an “extreme phenotype” design which increases power to detect association with rare variants. The subjects were Americans of Mexican, Puerto Rican, and African ancestry; the latter two populations present both the highest asthma prevalence and mortality and the lowest albuterol BDR. Mexican Americans have amongst the lowest prevalence of asthma in the United States. The study, supported by functional data, led to the identification of both population-specific and shared variants (rare and common) associated with BDR. Yet a major hurdle arose: the lack of access to comparable cohorts of similar age and ethnicity for replication. This example underscores the real need to increase the number of studies of ethnically diverse populations in bio-medical research. It is clear that patterns of genetic variation among populations can affect both disease risk and treatment efficacy and safety. Yet, a majority of studies still occur in European ancestry populations and the results can have limited utility across populations. This bias effectively translates into poorer disease prediction and treatment for individuals of under-represented ancestries. Importantly, studying diverse populations increases our ability to broadly understand genetic disease architectures that will, ultimately, lead to increased precision in medical care. In this commentary we have focused on genetic variation, but there are other types of variation among populations that influence phenotypic diversity. For example, the transcriptome, proteome, metabolome, and microbiome, which can all influence disease risk, are affected by genomic differences, but they also capture environmental differences, all of which affect disease susceptibility and outcomes. Failure to reach beyond Europeans can severely limit our knowledge base. Unfortunately, the Genotype-Tissue Expression (GTEx) project reflects the same bias that GWAS does, with more than 85% of samples being of European descent. In the United States there are ongoing efforts to include minority populations in biobank initiatives that have the capacity to yield extensive genetic data, including whole-exome and genome sequencing, and to connect genetic profiling to a wealth of electronic health records (Rader and Damrauer, 2016Rader D.J. Damrauer S.M. “Pheno”menal value for human health.Science. 2016; 354: 1534-1536Crossref PubMed Scopus (6) Google Scholar). The access to such a large amount of information opens the possibility of complementing the phenotype to genotype approach, typical of a GWAS, to its reverse: a genotype to phenotype strategy (PheWAS), where, for example, a given variant is tested for association with many recorded phenotypes (the “phenome”) due to pleiotropy. Although these resources can be useful in understanding and addressing health issues of minorities in high-income countries and thereby decrease some disparities, they do not recapitulate the genetic and environmental variation present in low- and middle-income countries (LMICs). Thus, there is a need to include the many overlooked populations that have so far been excluded from genetic research and its potential benefits. Despite the plea to include more diverse sampling in genomic studies and the critical knowledge these studies can bring, we recognize that obstacles remain. Recruiting diverse populations can be difficult in many settings, in some cases due to a mistrust in biomedical research stemming from past experiences of exploitation. To prevent this, local ethics committees have a key role in reviewing and approving proposals, securing compliance with guidelines, and the implementation of a broad range of requirements, from appropriate treatment of study subjects to full involvement of local stakeholders in all stages of research. To generate quality genetic associations, it is essential to obtain reliable phenotype data, which in turn requires both personnel and adequate facilities. In places where diversity may be the greatest (i.e., LMICs), investment in infrastructure and professional training is a primary need. These and other challenges require a concerted effort by both the research communities and funding agencies to include ethnically diverse populations in human genetics studies. Such access and subsequent research will improve our understanding of the genetics of disease and improve the quality of health care, for all. We thank Dana Crawford and Reed Pyeritz for critical feedback, and we thank Jacob Haut and Matthew Hansen for their assistance with constructing Figure 2. S.A.T. is supported by NIH grants 1R01DK104339, and 1R01GM113657 and an American Diabetes Association Pathway to Stop Diabetes Grant Pathway to Diabetes Visionary Award 1-19-VSN-02. The Missing Diversity in Human Genetic StudiesSirugo et al.CellMay 02, 2019In Brief(Cell 177, 26–31; March 21, 2019) Full-Text PDF Open Archive

Toll-like receptors (TLRs) and members of their signaling pathway are important in the initiation of the innate immune response to a wide variety of pathogens1,2,3. The adaptor protein Mal (also known as TIRAP), encoded by TIRAP (MIM 606252), mediates downstream signaling of TLR2 and TLR4 (refs. 4–6). We report a case-control study of 6,106 individuals from the UK, Vietnam and several African countries with invasive pneumococcal disease, bacteremia, malaria and tuberculosis. We genotyped 33 SNPs, including rs8177374, which encodes a leucine substitution at Ser180 of Mal. We found that heterozygous carriage of this variant associated independently with all four infectious diseases in the different study populations. Combining the study groups, we found substantial support for a protective effect of S180L heterozygosity against these infectious diseases (N = 6,106; overall P = 9.6 × 10−8). We found that the Mal S180L variant attenuated TLR2 signal transduction.

Survivin is a new IAP apoptosis inhibitor expressed during development and in human cancer in vivo. The coding strand of the survivin gene was extensively complementary to that of effector cell protease receptor-1 (EPR-1), prompting the present investigation on the origin and functional relationship of these two transcripts. Southern blots of genomic DNA were consistent with the presence of multiple, evolutionarily conserved, EPR-1/Survivin-related genes. By pulsed field gel electrophoresis and single- and two-color fluorescence in situ hybridization, these were contained within a contiguous physical interval of 75–130 kilobases (kb) on chromosome 17q25. In Northern blots, a single strand-specific probe identified a 1.3-kb EPR-1 mRNA broadly distributed in normal adult and fetal tissues, structurally distinct from the 1.9-kb Survivin transcript expressed in transformed cell lines. Transient co-transfection of an EPR-1 cDNA potentially acting as a Survivin antisense with a lacZ reporter plasmid resulted in loss of viability of HeLa cells. In contrast, co-transfection of an antisense cDNA of intercellular adhesion molecule-1 or a sense-oriented Survivin cDNA was without effect. In stably transfected HeLa cells, ZnSO4 induction of an EPR-1 mRNA under the control of a metallothionein promoter suppressed the expression of endogenous survivin. This resulted in (i) increased apoptosis as detected by analysis of DNA content and in situ internucleosomal DNA fragmentation and (ii) inhibition of cell proliferation as compared with induced vector control transfectants. These findings suggest the existence of a potential EPR-1/survivin gene cluster and identify survivin as a new target for disrupting cell viability pathways in cancer. Survivin is a new IAP apoptosis inhibitor expressed during development and in human cancer in vivo. The coding strand of the survivin gene was extensively complementary to that of effector cell protease receptor-1 (EPR-1), prompting the present investigation on the origin and functional relationship of these two transcripts. Southern blots of genomic DNA were consistent with the presence of multiple, evolutionarily conserved, EPR-1/Survivin-related genes. By pulsed field gel electrophoresis and single- and two-color fluorescence in situ hybridization, these were contained within a contiguous physical interval of 75–130 kilobases (kb) on chromosome 17q25. In Northern blots, a single strand-specific probe identified a 1.3-kb EPR-1 mRNA broadly distributed in normal adult and fetal tissues, structurally distinct from the 1.9-kb Survivin transcript expressed in transformed cell lines. Transient co-transfection of an EPR-1 cDNA potentially acting as a Survivin antisense with a lacZ reporter plasmid resulted in loss of viability of HeLa cells. In contrast, co-transfection of an antisense cDNA of intercellular adhesion molecule-1 or a sense-oriented Survivin cDNA was without effect. In stably transfected HeLa cells, ZnSO4 induction of an EPR-1 mRNA under the control of a metallothionein promoter suppressed the expression of endogenous survivin. This resulted in (i) increased apoptosis as detected by analysis of DNA content and in situ internucleosomal DNA fragmentation and (ii) inhibition of cell proliferation as compared with induced vector control transfectants. These findings suggest the existence of a potential EPR-1/survivin gene cluster and identify survivin as a new target for disrupting cell viability pathways in cancer. Regulated inhibition of programmed cell death (apoptosis) preserves normal homeostasis and tissue and organ morphogenesis (1Nagata S. Cell. 1997; 88: 355-365Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (4578) Google Scholar, 2Vaux D.L. Haecker G. Strasser A. Cell. 1994; 76: 777-779Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (705) Google Scholar). Aberrations of this process participate in human diseases and may contribute to cancer by abnormally prolonging cell viability with accumulation of transforming mutations (3Thompson C.B. Science. 1995; 267: 1456-1462Crossref PubMed Scopus (6244) Google Scholar). Recently, several apoptosis inhibitors related to the baculovirus iap gene have been identified in mouse, Drosophila, and human (4Clem R.J. Duckett C.S. Trends Cell Biol. 1997; 7: 337-339Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (90) Google Scholar). Intercalated in TNF receptor signaling (5Rothe M. Pan M.-G. Henzel W.J. Merrill-Ayres T. Goeddel D.V. Cell. 1995; 83: 1242-1252Abstract Full Text PDF Scopus (1062) Google Scholar, 6Uren A.G. Pakusch M. Hawkins C.J. Puls K.L. Vaux D.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 4974-4978Crossref PubMed Scopus (449) Google Scholar) and NF-κB-dependent survival (7Chu Z.-L. McKinsey T.A. Gentry J.J. Malim M.H. Ballard D.W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 10057-10062Crossref PubMed Scopus (830) Google Scholar), IAP proteins contain two/three Cys/His baculovirus IAP repeats plus a carboxyl terminus RING finger and are thought to block an evolutionarily conserved step in apoptosis (6Uren A.G. Pakusch M. Hawkins C.J. Puls K.L. Vaux D.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 4974-4978Crossref PubMed Scopus (449) Google Scholar, 8Liston P. Roy N. Tamal K. Lefebvre C. Baird S. Cherton-Horvat G. Farahani R. McLean M. Ikeda J.-E. MacKenzie A. Korneluk R.G. Nature. 1996; 379: 349-353Crossref PubMed Scopus (876) Google Scholar, 9Roy N. Mahadevan M.S. McLean M. Shutler G. Yaraghi Z. Farahani R. Baird S. Besner-Johnston A. Lefebvre C. Kang X. Salith M. Aubry H. Tamai K. Guan X. Ioannou P. Crawford T.O. de Jong P.J. Surh L. Ikeda J.-E. Korneluk R.G. MacKenzie A. Cell. 1995; 80: 167-178Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (881) Google Scholar, 10Duckett C.S. Nava V.E. Gedrich R.W. Clem R.J. Van Dongen J.L. Gilfillan M.C. Shiels H. Hardwich J.M. Thompson C.B. EMBO J. 1996; 14: 2685-2694Crossref Scopus (526) Google Scholar). At least in the case of XIAP (8Liston P. Roy N. Tamal K. Lefebvre C. Baird S. Cherton-Horvat G. Farahani R. McLean M. Ikeda J.-E. MacKenzie A. Korneluk R.G. Nature. 1996; 379: 349-353Crossref PubMed Scopus (876) Google Scholar), this may involve direct inhibition of the terminal effector caspases −3 and −7 (11Deveraux Q.L. Takahashi R. Salvesen G.S. Reed J. Nature. 1997; 388: 300-304Crossref PubMed Scopus (1732) Google Scholar). A novel member of the IAP gene family, designated Survivin (12Ambrosini G. Adida C. Altieri D.C. Nat. Med. 1997; 3: 917-921Crossref PubMed Scopus (3049) Google Scholar), was recently identified by hybridization screening of human genomic libraries with the cDNA of a factor Xa receptor, effector cell protease receptor-1 (EPR-1) (13Altieri D.C. FASEB J. 1995; 9: 860-865Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar). 1The abbreviations used are: EPR-1, effector cell protease receptor-1; kb, kilobase(s); nt, nucleotide(s). Unlike all other IAP proteins (4Clem R.J. Duckett C.S. Trends Cell Biol. 1997; 7: 337-339Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (90) Google Scholar), Survivin contained a single baculovirus IAP repeat and no RING finger and was selectively expressed during development and in all the most common human cancers but not in normal adult tissues in vivo (12Ambrosini G. Adida C. Altieri D.C. Nat. Med. 1997; 3: 917-921Crossref PubMed Scopus (3049) Google Scholar). Intriguingly, the Survivin coding strand was extensively complementary to that of EPR-1, thus suggesting a potential functional interaction between these two transcripts (12Ambrosini G. Adida C. Altieri D.C. Nat. Med. 1997; 3: 917-921Crossref PubMed Scopus (3049) Google Scholar). In this study, we sought to dissect the molecular relationship between EPR-1 and Survivin (12Ambrosini G. Adida C. Altieri D.C. Nat. Med. 1997; 3: 917-921Crossref PubMed Scopus (3049) Google Scholar, 13Altieri D.C. FASEB J. 1995; 9: 860-865Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar) and its role in apoptosis inhibition. We found that EPR-1 and Survivin are encoded by structurally and topographically distinct messages potentially originating from a gene cluster at 17q25. Secondly, down-regulation of Survivin by forced expression of EPR-1 increased apoptosis and inhibited growth of transformed cells. Peripheral blood mononuclear cells were isolated from heparinized blood collected from normal informed volunteers by differential centrifugation on Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech) at 400 × g for 22 °C and washed in phosphate-buffered saline, pH 7.4. The epithelial carcinoma HeLa cell line was obtained from American Type Culture Collection (Rockville, MD) and maintained in culture in complete growth medium (BioWhittaker, Walkersville, MD) supplemented with 10% fetal bovine serum (BioWhittaker) and 2 mml-glutamine, according to the manufacturer's specifications. For fluorescence in situ hybridization, purified DNA from a Survivin P1 genomic clone (12Ambrosini G. Adida C. Altieri D.C. Nat. Med. 1997; 3: 917-921Crossref PubMed Scopus (3049) Google Scholar) was labeled with digoxigenin dUTP (Amersham Pharmacia Biotech) by nick translation, combined with sheared human DNA, and hybridized to normal metaphase chromosomes derived from phytohemagglutinin-stimulated peripheral blood mononuclear cells in 50% formamide, 10% dextran sulfate, and 2× SSC. For two-color staining, biotin-conjugated probe D17Z1, specific for the centromere of chromosome 17, was co-hybridized with the digoxigenin-labeled P1 clone. Specific chromosomal staining was detected by fluoresceinated anti-digoxigenin antibodies and Texas red avidin. Slides were counterstained with propidium iodide or DAPI for one- or two-color labeling, respectively. A total of 80 metaphase cells were analyzed with 69 cells exhibiting specific labeling. Human genomic DNA was extracted from HeLa cells, digested with EcoRI, BamHI,XbaI, or HindIII, separated on a 0.8% agarose gel and transferred to GeneScreen nylon membranes (NEN Life Science Products). After UV cross-linking (Stratagene, San Diego, CA), the membrane was prehybridized with 100 μg/ml of denatured salmon sperm DNA (Promega Corp., Madison, WI) in 5× SSC, 0.5% SDS, 5× Denhardt's solution, and 0.1% sodium pyrophosphate at 65 °C in a roller hybridization oven (Hoefer Scientific, San Francisco, CA). Hybridization was carried out with gel-purified (GeneClean Bio101, Vista, CA), [32P]dCTP (Amersham Pharmacia Biotech) random-primed labeled (Boehringer Mannheim) 1.6-kb EPR-1 cDNA (13Altieri D.C. FASEB J. 1995; 9: 860-865Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar) for 16 h at 65 °C. After two washes in 2× SSC, 1% SDS for 30 min at 65 °C, and 0.2× SSC at 22 °C, radioactive bands were visualized by autoradiography using a Kodak X-Omat AR x-ray film and intensifying screens (DuPont). In other experiments, cultured lymphoblastoid cells were embedded in low melting preparative agarose (Bio-Rad) at the concentration of 2 × 106/220 μl block, and DNA was extracted by standard procedures. After block digestion with MluI or NotI, samples were separated by pulsed field gel electrophoresis on a 1% agarose gel for 20 h at 200 V with a pulse time of 75 s using a Bio-Rad CHEF DRII apparatus. After transfer to nylon membranes and UV cross-linking, hybridization with the EPR-1 cDNA and washes were carried out as described. In another series of experiments, a blot containing aliquots of genomic DNA isolated from several species (CLONTECH, San Francisco, CA) was hybridized with a 3′ 548-nt fragment of the EPR-1 cDNA, as described above. Multiple tissue blots of adult and fetal mRNA (CLONTECH) were prehybridized with 100 μg/ml of denatured salmon sperm DNA (Promega) and hybridized with an EPR-1-single strand-specific probe (see below) in 5× SSPE, 10× Denhardt's, 2% SDS, for 14 h at 60 °C. The membranes were washed twice in 2× SSC, 1% SDS for 30 min at 60 °C and once in 0.2× SSC at 22 °C before exposure for autoradiography. An EPR-1-specific single strand probe was generated by asymmetric polymerase chain reaction amplification of a 301-nt fragment of the EPR-1 cDNA generated by EcoRI (cloning site) andSacII digest and comprising the first 5′ 226 nt of the EPR-1 coding sequence plus 75 nt of the retained regulatory intron (13Altieri D.C. FASEB J. 1995; 9: 860-865Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar). The gel-purified fragment was mixed with 15 pmol dNTP (New England Biolabs, Beverly, MA), 7.5 pmol of dCTP, and 25 μCi of [32P]dCTP (Amersham Pharmacia Biotech) in 20 mm Tris HCl, 50 mm KCl, pH 8.4, 1.5 mm MgCl2, plus 0.2 μg/μl of a SacII reverse EPR-1 primer 5′TGCTGGCCGCTCCTCCCTC3′ and 2.5 units of Taq DNA polymerase (Life Science) in a total volume of 10 μl. 25 cycles of amplification were carried out with denaturation at 94 °C for 1 min, annealing at 52 °C for 1 min, and extension at 72 °C for 1 min. After centrifugation through a Sephadex G-50 spin column (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ) at 14,000 × g for 5 min, the EPR-1 or Survivin probes were heated at 100 °C for 2 min and immediately added to the various hybridization reactions. A control antisense construct of intercellular adhesion molecule-1 was generated by polymerase chain reaction amplification of the full-length human intercellular adhesion molecule-1 cDNA (14Simmons D. Makgoba M.W. Seed B. Nature. 1988; 331: 624-627Crossref PubMed Scopus (582) Google Scholar) using oligonucleotides 5′-GATCTAGACTCGCTATGGCTCCCAGC-3′ and 5′-CCGCAAGCTTTCAGGGAGGCGTGGCTTG-3′ containingXbaI and HindIII restriction sites, respectively (underlined sequences). The amplified product of 1605 nt was gel purified and directionally cloned in pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) for transfection in HeLa cells. A 708-ntSmaI-EcoRI fragment of the EPR-1 cDNA (nt 379–1087) (13Altieri D.C. FASEB J. 1995; 9: 860-865Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar), potentially acting as a Survivin antisense, and a sense-oriented Survivin construct (12Ambrosini G. Adida C. Altieri D.C. Nat. Med. 1997; 3: 917-921Crossref PubMed Scopus (3049) Google Scholar) were also used for these experiments. Subconfluent cultures of HeLa cells in 6-well tissue culture plates were cotransfected with 1 μg of lacZ reporter plasmid and 4 μg of the various sense- and antisense-oriented constructs or the empty pcDNA3 vector using LipofectAMINE (Life Technologies, Inc.). 48 h after transfection, cells were fixed in 2% paraformaldehyde for 1 h and stained for β-galactosidase expression with 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-d-galactoside (Amersham Pharmacia Biotech), 5 mm potassium ferrocyanide, 5 mm potassium ferricyanide, and 2 mm MgCl2 in phosphate-buffered saline. The blue cells were counted and scored on an inverted microscope. In another series of experiments, HeLa cells (1 × 107) were transfected with 10 μg of control pcDNA3 vector alone or the survivin antisense cDNA plus 50 μg of salmon sperm DNA by electroporation (Gene Pulser, Bio-Rad) with a single electric pulse at 350 V at 960 microfarads. 48 h after transfection, HeLa cells were collected by trypsinization, pooled with nonattached cells, and fixed in 70% ethanol on ice for 30 min. Fixed cells were pelletted by centrifugation and suspended in 10 μg/ml propidium iodide, 100 μg/ml RNase A, and 0.05% Triton X-100 in phosphate-buffered saline, pH 7.4. After a 45-min incubation at 22 °C, samples were analyzed for DNA content by flow cytometry using a FACScan (Becton Dickinson). The 708-nt SmaI-EcoRI fragment of the EPR-1 cDNA (see above) was directionally cloned in the sense orientation in the mammalian cell expression vector pML1 (a gift of Dr. R. Pytela, University of California, San Francisco). The vector is derived from the episomal mammalian expression vector pCEP4 by replacing the cytomegalovirus promoter cassette with the mMT1 promoter, directing Zn2+-dependent expression of recombinant proteins in mammalian cells (15Lukashev M.E. Sheppard D. Pytela R. J. Biol. Chem. 1994; 269: 18311-18314Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). 10 million HeLa cells were transfected with 10 μg of control pcDNA3 vector or the Survivin antisense by electroporation as described above. 48 h after transfection, cells were diluted, plated onto 100-mm diameter tissue culture dishes, and selected for 4 weeks in complete growth medium containing 0.4 mg/ml hygromycin. Modulation of survivin expression in control cultures or Zn2+-induced antisense transfectants was carried by immunoblotting of detergent-solubilized cell extracts using 25 μg/ml aliquots of the affinity-purified antibody raised against the survivin sequence Ala3–Ile19, as described (12Ambrosini G. Adida C. Altieri D.C. Nat. Med. 1997; 3: 917-921Crossref PubMed Scopus (3049) Google Scholar). In control experiments, Zn2+-induced vector control or survivin antisense transfectants were analyzed for modulation of Class I major histocompatibility complex by flow cytometry with monoclonal antibody W6/32. Vector control or Survivin antisense transfectants were treated with 200 μm ZnSO4in 0% fetal bovine serum for 24 h at 37 °C following byin situ determination of apoptosis by internucleosomal DNA fragmentation (TUNEL). Briefly, cells were harvested and centrifuged at 800 × g for 10 min at 4 °C, the pellet was fixed in 10% formalin overnight, dehydrated, and embedded in paraffin blocks, and sections of 3–5 μm were put on high adhesive slides. Samples were treated with 20 μg/ml proteinase K for 15 min at 22 °C, washed in distilled water, quenched of endogenous peroxidase in 2% H2O2 in phosphate-buffered saline, and subsequently mixed with digoxigenin-labeled dUTP in the presence of terminal deoxynucleotidyl transferase followed by peroxidase-conjugated anti-digoxigenin antibody. Nuclear staining in apoptotic cells was detected by 3′, 3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride dihydrate, according to the manufacturer's instructions (ApopTag, Oncor, Gaithersburg, MD). For control experiments, the enzyme incubation step was omitted. Morphologic features of apoptotic cells (apoptotic bodies) under the various conditions tested were also analyzed by hematoxylin/eosin staining. For proliferation experiments, vector control or Survivin antisense transfectants at 2 × 104/well were plated in 24-well tissue culture plates (Costar) and induced with 200 μm ZnSO4 in complete growth medium for 16 h at 37 °C, and cell proliferation was determined microscopically at 24 h intervals by direct cell count. Two independent clones of HeLa cell transfectants were used in these experiments with comparable results. In some experiments, analysis of DNA content in induced vector control or Survivin antisense transfectants in complete growth medium was carried out by propidium iodide staining and flow cytometry, as described above. A digoxigenin-labeled P1 genomic clone (∼100 kb) containing all four exons of the survivin gene (12Ambrosini G. Adida C. Altieri D.C. Nat. Med. 1997; 3: 917-921Crossref PubMed Scopus (3049) Google Scholar) specifically labeled a single region on the long arm of a group E chromosome by fluorescencein situ hybridization (Fig. 1 A). In two-color staining with probe D17Z1 specific for the centromere of chromosome 17, the Survivin P1 clone reacted with the long arm of chromosome 17 with band 17q25 (Fig. 1, A and B). Probing human genomic DNA with the EPR-1 cDNA revealed several hybridizing bands (Fig. 2 A). Of these, a ∼7.5-kb XbaI, a 7.6-kb BamHI, and four HindIII fragments of ∼15, 7.5, 6.4, and 3.7 kb, respectively (Fig. 2 A, arrowheads), were not predicted from the complete restriction map of 14,796 nt of thesurvivin gene (12Ambrosini G. Adida C. Altieri D.C. Nat. Med. 1997; 3: 917-921Crossref PubMed Scopus (3049) Google Scholar). In contrast, other bands of comparable intensity, including a 5.1-kb XbaI and a 7.1-kbBamHI fragment, or of stronger intensity, including fragments of 17.5-kb HindIII, 10.5-kb XbaI, 8.5-kb BamHI, and ∼25-kb EcoRI (Fig. 2 A), genuinely originated from the survivin gene (12Ambrosini G. Adida C. Altieri D.C. Nat. Med. 1997; 3: 917-921Crossref PubMed Scopus (3049) Google Scholar). At variance with this complex hybridization pattern, pulsed field gel electrophoresis of high molecular mass human genomic DNA revealed only single EPR-1-hybridizing bands of ∼75 and ∼130 kb inMluI- or NotI-digested samples, respectively (Fig. 2 B). Finally, the EPR-1 cDNA strongly hybridized with several bands in genomic DNA from various mammalian species, with fainter signals in rabbit or chicken DNA (Fig. 2 C). Consistent with the size of the spliced EPR-1 message (13Altieri D.C. FASEB J. 1995; 9: 860-865Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar), a single strand EPR-1-specific probe detected a prominent ∼1.3-kb EPR-1 mRNA band in most adult and terminally differentiated human tissues (Fig. 3,upper panel). Strong EPR-1 expression was observed in human pancreas, skeletal muscle, heart, and various hematopoietic cell types, including peripheral blood leukocytes, lymph node, and spleen (Fig. 3,upper panel). Consistent with the reactivity of an anti-EPR-1 antibody with fetal tissues (16Adida C. Crotty P.L. McGrath J. Berrebi D. Diebold J. Altieri D.C. Am. J. Pathol. 1998; 152: 43-49PubMed Google Scholar), a 1.3-kb EPR-1 mRNA was also found prominently in fetal kidney and liver and less abundantly in fetal lung and brain (Fig. 3, lower panel). Control hybridization with an actin probe confirmed comparable loading of mRNA in the various fetal samples (Fig. 3). In contrast, a Survivin-specific single strand probe did not react with mRNA isolated from normal adult tissues (12Ambrosini G. Adida C. Altieri D.C. Nat. Med. 1997; 3: 917-921Crossref PubMed Scopus (3049) Google Scholar), whereas it detected a prominent ∼1.9-kb transcript plus a fainter 3.4-kb species in various transformed cell lines (not shown) and in agreement with previous observations (12Ambrosini G. Adida C. Altieri D.C. Nat. Med. 1997; 3: 917-921Crossref PubMed Scopus (3049) Google Scholar). Transient co-transfection of HeLa cells with an EPR-1 cDNA potentially acting as a Survivin antisense plus alacZ reporter plasmid produced significant loss of viability in β-galactosidase-expressing cells (Fig. 4). In contrast, co-transfection of pcDNA3 vector alone, a sense-oriented Survivin construct, or a control antisense of intercellular adhesion molecule-1 cDNA did not affect HeLa cell viability under the same experimental conditions (Fig. 4). To determine more precisely the effect of regulated expression of EPR-1 on Survivin inhibition of apoptosis, HeLa cells were stably transfected with an EPR-1 cDNA under the control of an metallothionein-inducible promoter. In these experiments, ZnSO4 induction of EPR-1 mRNA suppressed the expression of endogenous Survivin, as determined by immunoblotting with an anti-Survivin antibody (Fig. 5 A). In contrast and consistent with the expression of Survivin in transformed cell types, a single 16.5-kDa Survivin band was immunoblotted in metallothionein-induced HeLa cells transfected with the pML1 vector alone (Fig. 5 A). In control experiments, metallothionein induction of EPR-1 mRNA did not affect the expression of Class I major histocompatibility complex molecules in HeLa cell transfectants, and no modulation of Survivin expression was observed in the absence of ZnSO4 (not shown). Under these experimental conditions, antisense down-regulation of Survivin resulted in massive apoptosis in growth factor-deprived HeLa cells, as detected by in situinternucleosomal DNA fragmentation by the TUNEL system (Fig. 5 B, panel 1). Specific nuclear staining was observed in 60–70% of metallothionein-induced, serum-starved HeLa cell transfectants, whereas induced vector control cultures did not stain with the digoxigenin-labeled dUTP probe (Fig. 5 B,panel 3). No staining was observed in the absence of terminal deoxynucleotidyl transferase labeling (not shown). Hematoxylin/eosin staining confirmed the presence of numerous apoptotic bodies in ZnSO4-induced Survivin antisense transfectants, as compared with vector control HeLa cells (Fig. 5 B,panels 2 and 4, arrowheads). The effect of antisense down-regulation of Survivin on HeLa cell proliferation was also investigated. As shown in Fig. 6 A, suppression of endogenous Survivin resulted in significant inhibition of cell proliferation, as compared with induced vector control cultures (Fig. 6 A). 3 days after metallothionein induction, the number of vector control HeLa cell transfectants increased by 288% during optimal serum mitogen stimulation, as opposed to a 20% increase in Survivin antisense transfectants, under the same experimental conditions (Fig. 6 A). The increased cell proliferation observed at later time intervals (days 4–5) in induced antisense transfectants may reflect heterogeneity in antisense expression with selective expansion of low expressing cells (Fig. 6 A). The potential ability of Survivin to modulate apoptosis and cell proliferation under optimal concentrations of serum mitogens was further investigated. Analysis of DNA content in transiently transfected HeLa cells revealed a ∼2-fold increase in the fraction of apoptotic cells (sub-G1 peak) in Survivin antisense transfectants as compared with vector control cells, under the same experimental conditions (Fig. 6 B,M1 marker). This was also associated with a ∼15–20% decrease in the G2/M fraction in Survivin antisense transfectants, as compared with vector control cultures (Fig. 6 B, M4 marker). In stable HeLa cell transfectants, zinc induction of Survivin antisense under optimal growth conditions produced a ∼1.4-fold increase in the sub-G1 fraction and a ∼20–36% reduction in the G2/M peak, as compared with induced vector control cultures (n = 2).Figure 5Effect of metallothionein induction of EPR-1 mRNA on Survivin expression and apoptosis. A, aliquots of HeLa cells stably transfected with the empty pML1 vector (Vector) or the EPR-1 cDNA potentially acting as a Survivin antisense (Antisense) were induced with 200 μm ZnSO4, detergent-solubilized, and immunoblotted with the anti-survivin antibody. Molecular weight (×10−3) markers are shown on the left.B, the experimental conditions are as in A, except that serum-starved Survivin antisense transfectants (1 and 2) or vector control cells (3and 4) were stained for internucleosomal DNA fragmentation by the ApopTag method (TUNEL) (1 and 3) or by hematoxylin-eosin (2 and 4).Arrowheads, apoptotic bodies. Magnification, ×400.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)Figure 6Inhibition of cell proliferation by Survivin antisense. A, 20,000 vector control HeLa cell transfectants (Vector) or Survivin antisense transfectants were seeded in 24-well plates in complete growth medium, induced with 200 μm ZnSO4, and harvested at the indicated time intervals with determination of cell proliferation by direct cell count. Data are the means ± S.E. of replicates of a representative experiment out of seven independent determinations.B, HeLa cells were transiently transfected by electroporation with control vector pcDNA3 or the survivin antisense cDNA. After a 48-h culture in complete growth medium, cells were analyzed for DNA content by propidium iodide staining and flow cytometry. The M1 marker contains the sub-G1 apoptotic fraction (18.2% in Survivin antisense transfectants versus 9.6% in vector control cells), whereas the M4 marker contains the proliferating G2/M fraction (18% in Survivin antisense transfectants versus21% in vector control cells).View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) In this study, we have shown that EPR-1 (13Altieri D.C. FASEB J. 1995; 9: 860-865Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar) and Survivin (12Ambrosini G. Adida C. Altieri D.C. Nat. Med. 1997; 3: 917-921Crossref PubMed Scopus (3049) Google Scholar) are encoded by structurally and topographically distinct mRNA transcripts potentially originating from a gene cluster at 17q25. Secondly, constitutive or metallothionein induction of EPR-1, potentially acting as a Survivin antisense, down-regulated endogenous Survivin in transformed cells and resulted in increased apoptosis and inhibition of cell proliferation, even in the presence of optimal serum mitogen concentrations. Among the regulators of programmed cell death (apoptosis), IAP proteins have recently attracted considerable attention for their ability to suppress an evolutionarily conserved step in apoptosis (4Clem R.J. Duckett C.S. Trends Cell Biol. 1997; 7: 337-339Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (90) Google Scholar), potentially involving direct caspase inhibition (11Deveraux Q.L. Takahashi R. Salvesen G.S. Reed J. Nature. 1997; 388: 300-304Crossref PubMed Scopus (1732) Google Scholar). Deregulation of this pathway may also participate in human diseases, because inactivating mutations of neuronal apoptosis inhibitory protein contributed to spinal muscular atrophy (9Roy N. Mahadevan M.S. McLean M. Shutler G. Yaraghi Z. Farahani R. Baird S. Besner-Johnston A. Lefebvre C. Kang X. Salith M. Aubry H. Tamai K. Guan X. Ioannou P. Crawford T.O. de Jong P.J. Surh L. Ikeda J.-E. Korneluk R.G. MacKenzie A. Cell. 1995; 80: 167-178Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (881) Google Scholar), and this molecule was cytoprotective against cerebral ischemia in vivo (17Xu D.G. Crocker S.J. Doucet J.-P. St-Jean M. Tamai K. Hakim A.M. Ikeda J.-E. Liston P. Thompson C.S. Korneluk R.G. MacKenzie A. Robertson G.S. Nat. Med. 1997; 3: 997-1004Crossref PubMed Scopus (224) Google Scholar). More recently, this paradigm has been extended to cancer, with the identification of Survivin as a structurally unique IAP protein selectively expressed during development and in all the most common human cancers but not in normal adult tissues in vivo (12Ambrosini G. Adida C. Altieri D.C. Nat. Med. 1997; 3: 917-921Crossref PubMed Scopus (3049) Google Scholar). Intriguingly, thesurvivin gene was identified by hybridization with the EPR-1 cDNA, and its coding sequence was found to be extensively complementary to that of EPR-1 (12Ambrosini G. Adida C. Altieri D.C. Nat. Med. 1997; 3: 917-921Crossref PubMed Scopus (3049) Google Scholar), suggesting the possibility of apoptosis regulation by a potential interaction between these two transcripts, i.e. natural antisense (18Kimmelman D. Kischner M.W. Cell. 1989; 59: 687-696Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (268) Google Scholar, 19Farrell C.M. Lukens L.N. J. Biol. Chem. 1995; 270: 3400-3408Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (54) Google Scholar, 20Celano P. Berchtold C.M. Kizer D.L. Weeraratna A. Nelkin B.D. Baylin S.B. Casero Jr., R.A. J. Biol. Chem. 1992; 267: 15092-15096Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 21Khochbin S. Lawrence J. EMBO J. 1989; 8: 4107-4114Crossref PubMed Scopus (81) Google Scholar). Here, Southern blots of human genomic DNA were consistent with the presence of multiple, evolutionarily conserved, EPR-1/Survivin-related genes, with several hybridizing fragments that could not be recapitulated by the complete physical map of 14,796 nt of thesurvivin gene (12Ambrosini G. Adida C. Altieri D.C. Nat. Med. 1997; 3: 917-921Crossref PubMed Scopus (3049) Google Scholar). Despite this complex hybridization pattern, pulsed field gel electrophoresis and fluorescence in situ hybridization studies suggested the existence of a single EPR-1/Survivin locus spanning 75–130 kb on chromosome 17q25. Although mammalian genes transcribed in both directions have been described (22Adelman J.P. Bond C.T. Douglass J. Herbert E. Science. 1987; 235: 1514-1517Crossref PubMed Scopus (167) Google Scholar,23Kindy M.S. McCormack J.E. Buckler A.J. Levine R.A. Sonenshein G.E. Mol. Cell. Biol. 1987; 7: 2857-2862Crossref PubMed Scopus (44) Google Scholar), these data are more consistent with a model of separate genes encoding EPR-1 and Survivin, potentially arisen from duplication event(s) and clustered in relatively close proximity at 17q25 in a head-to-head configuration (24Graham G.J. J. Theor. Biol. 1995; 175: 71-87Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar). The use of single strand-specific probes further demonstrated that EPR-1 and Survivin originated from two structurally different messages of 1.3 and 1.9 kb, respectively, expressed in a mutually exclusive fashion in adult and fetal tissues (12Ambrosini G. Adida C. Altieri D.C. Nat. Med. 1997; 3: 917-921Crossref PubMed Scopus (3049) Google Scholar, 16Adida C. Crotty P.L. McGrath J. Berrebi D. Diebold J. Altieri D.C. Am. J. Pathol. 1998; 152: 43-49PubMed Google Scholar). This is consistent with the heterogeneity of EPR-1 transcripts detected by conventional, double strand probes with hybridizing bands of 1.9, 3.4, and ∼1.5 kb previously identified in EPR-1+ cells (25Nicholson A.C. Nachman R.L. Altieri D.C. Summers B.D. Ruf W. Edgington T.S. Hajjar D.P. J. Biol. Chem. 1996; 271: 28407-28413Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (76) Google Scholar). Although it is currently not known if these two messages actually interact in vivo, we found that metallothionein induction of an EPR-1 mRNA suppressed the expression of endogenous Survivin in transfected cells. Consistent with the anti-apoptosis properties of Survivin (12Ambrosini G. Adida C. Altieri D.C. Nat. Med. 1997; 3: 917-921Crossref PubMed Scopus (3049) Google Scholar), this resulted in increased apoptosis and significant inhibition of cell proliferation. Although accentuated by serum mitogen withdrawal, HeLa cell apoptosis following antisense down-regulation of Survivin was also observed under optimal growth conditions and was associated with a reduced number of proliferating cells in the G2/M fraction. In these experiments, the use of a noncoding EPR-1 cDNA potentially acting as a Survivin antisense ruled out the possibility that inhibition of Survivin was due to protein interactions. It is also unlikely that ZnSO4 induction of the metallothionein promoter may exert an independent anti-apoptotic function, because this has been attributed to ZnCl2, at concentrations 5–10-fold higher than those used here (26Newmeyer D.D. Farschon D.M. Reed J.C. Cell. 1994; 79: 353-364Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (499) Google Scholar). The findings described here may have profound implications for cancer therapy, where antisense-based strategies have been postulated for inhibition of several proto-oncogenes (27Henry S.P. Monteith D. Levin A.A. Anti-Cancer Drug Des. 1997; 12: 395-408PubMed Google Scholar). Specifically, antisense blockade of anti-apoptotic bcl-2 decreased survival of leukemic cells in vitro (28Campos L. Sabido O. Rouault J.P. Guyotat D. Blood. 1994; 84: 595-600Crossref PubMed Google Scholar), reduced tumorigenicity of lymphoma cells in athymic mice (29Reed J.C. Cuddy M. Haldar S. Croce C. Nowell P. Makover D. Bradley K. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990; 87: 3660-3664Crossref PubMed Scopus (166) Google Scholar), and provided, at least in some cases, a positive therapeutic response in patients with non-Hodgkin's lymphoma (30Webb A. Cunningham D. Cotter F. Clarke P.A. di Stefano F. Ross P. Corbo M. Dziewanowska Z. Lancet. 1997; 349: 1137-1141Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (485) Google Scholar). In this context and consistent with the data presented here, targeting Survivin may selectively increase the susceptibility of cancer cells to apoptosis-based treatment and reduce their overall growth potential. In addition to inhibiting cell viability pathways distinct and complementary with those of bcl-2 (11Deveraux Q.L. Takahashi R. Salvesen G.S. Reed J. Nature. 1997; 388: 300-304Crossref PubMed Scopus (1732) Google Scholar), suppression of Survivin by an endogenous EPR-1 transcript potentially acting as a natural antisense may overcome the drawbacks of limited specificity and insufficient delivery commonly observed with antisense oligonucleotides (27Henry S.P. Monteith D. Levin A.A. Anti-Cancer Drug Des. 1997; 12: 395-408PubMed Google Scholar). Elucidation of the mechanisms regulating Survivin and EPR-1 gene expression should further facilitate the selective disruption of this novel anti-apoptosis pathway in cancer without affecting viability of normal tissues. We thank Dr. Pytela for providing the pML1 vector.

Dominic Kwiatkowski and colleagues of the MalariaGEN and the WTCCC consortiums report a genome-wide analysis of severe malaria in The Gambia. They provide guidance for design of GWAS in African populations, and demonstrate the usefulness of multipoint imputation based on population-specific sequencing data. We report a genome-wide association (GWA) study of severe malaria in The Gambia. The initial GWA scan included 2,500 children genotyped on the Affymetrix 500K GeneChip, and a replication study included 3,400 children. We used this to examine the performance of GWA methods in Africa. We found considerable population stratification, and also that signals of association at known malaria resistance loci were greatly attenuated owing to weak linkage disequilibrium (LD). To investigate possible solutions to the problem of low LD, we focused on the HbS locus, sequencing this region of the genome in 62 Gambian individuals and then using these data to conduct multipoint imputation in the GWA samples. This increased the signal of association, from P = 4 × 10−7 to P = 4 × 10−14, with the peak of the signal located precisely at the HbS causal variant. Our findings provide proof of principle that fine-resolution multipoint imputation, based on population-specific sequencing data, can substantially boost authentic GWA signals and enable fine mapping of causal variants in African populations.

Abstract Host genetic factors can confer resistance against malaria, raising the question of whether this has led to evolutionary adaptation of parasite populations. In this study we investigated the correlation between host and parasite genetic variation in 4,171 Gambian and Kenya children ascertained with severe malaria due to Plasmodium falciparum . We identified a strong association between sickle haemoglobin (HbS) in the host and variation in three regions of the parasite genome, including nonsynonymous variants in the acyl-CoA synthetase family member PfACS8 on chromosome 2, in a second region of chromosome 2, and in a region containing structural variation on chromosome 11. The HbS-associated parasite alleles are in strong linkage disequilibrium and have frequencies which covary with the frequency of HbS across populations, in particular being much more common in Africa than other parts of the world. The estimated protective effect of HbS against severe malaria, as determined by comparison of cases with population controls, varies greatly according to the parasite genotype at these three loci. These findings open up a new avenue of enquiry into the biological and epidemiological significance of the HbS-associated polymorphisms in the parasite genome, and the evolutionary forces that have led to their high frequency and strong linkage disequilibrium in African P. falciparum populations.

Research participants report interest in receiving genetic research results. How best to return results remains unclear. In this randomized pilot study, we sought to assess the feasibility of returning actionable research results through a two-step process including a patient-centered digital intervention as compared to a genetic counselor (GC) in the Penn Medicine biobank. In Step 1, participants with an actionable result and procedural controls (no actionable result) were invited to digital pre-disclosure education and provided options for opting out of results. In Step 2, those with actionable results who had not opted out were randomized to receive results via a digital disclosure intervention or with a GC. Five participants (2%) opted out of results after Step 1. After both steps, 52/113 (46.0%) of eligible cases received results, 5 (4.4%) actively declined results, 34 (30.1%) passively declined and 22 (19.5%) could not be reached. Receiving results was associated with younger age (p<0.001), completing pre-disclosure education (p<0.001) and being in the GC arm (p=0.06). Being older, female, and of Black race were associated with being unable to reach. Older age and Black race were associated with passively declining. 47% of those who received results did not have personal or family history to suggest the mutation, and 55.1% completed clinical confirmation testing. The use of digital tools may be acceptable to participants and could reduce costs of returning results. Low uptake, disparities in uptake, and barriers to confirmation testing will be important to address to realize the benefit of returning actionable research results.

Genetic studies of both the human host and Mycobacterium tuberculosis (MTB) demonstrate independent association with tuberculosis (TB) risk. However, neither explains a large portion of disease risk or severity. Based on studies in other infectious diseases and animal models of TB, we hypothesized that the genomes of the two interact to modulate risk of developing active TB or increasing the severity of disease, when present. We examined this hypothesis in our TB household contact study in Kampala, Uganda, in which there were 3 MTB lineages of which L4-Ugandan (L4.6) is the most recent. TB severity, measured using the Bandim TBscore, was modeled as a function of host SNP genotype, MTB lineage, and their interaction, within two independent cohorts of TB cases, N=113 and 122. No association was found between lineage and severity, but association between multiple polymorphisms in IL12B and TBscore was replicated in two independent cohorts (most significant rs3212227, combined p=0.0006), supporting previous associations of IL12B with TB susceptibility. We also observed significant interaction between a single nucleotide polymorphism (SNP) in SLC11A1 and the L4-Ugandan lineage in both cohorts (rs17235409, meta p=0.0002). Interestingly, the presence of the L4-Uganda lineage in the presence of the ancestral human allele associated with more severe disease. These findings demonstrate that IL12B is associated with severity of TB in addition to susceptibility, and that the association between TB severity and human genetics can be due to an interaction between genes in the two species, providing evidence of host-pathogen coevolution in TB.