Mycobacterium Tuberculosis ( Mtb ) is a pathogenic bacterium and a causative agent of tuberculosis (TB) that kills more than 1.5 million people worldwide annually. One of the main reasons for this high mortality rate is the evolution of new Mtb strains that are resistant to available antibiotics. Therefore, new therapeutics for TB are in constant demand. Here we report the development of such inhibitors that target two DNA replication enzymes of Mtb , namely DnaG primase and DNA gyrase, which share a conserved TOPRIM fold near the inhibitors’ binding site. The molecules were developed on the basis of inhibitors for T7 primase that bind to the TOPRIM fold. In order to improve the physicochemical properties of the molecules and inhibition of these two enzymes, 49 novel compounds were synthesized as potential drug candidates in three stages of optimization. The last stage of chemical optimization yielded two novel inhibitors for the fast-growing nonpathogenic model Mycobacterium smegmatis ( Msmg ).

Primases are key enzymes involved in DNA replication. They act on single-stranded DNA, and catalyze the synthesis of short RNA primers used by DNA polymerases. Here, we investigate the DNA-binding and activity of the bacteriophage T7 primase using a new workflow called High-Throughput Primase Profiling (HTPP). Using a unique combination of high-throughput binding assays and biochemical analyses, HTPP reveals a complex landscape of binding specificity and functional activity for the T7 primase, determined by sequences flanking the primase recognition site. We identified specific features, such as G/T-rich flanks, which increase primase-DNA binding up to 10-fold and, surprisingly, also increase the length of newly formed RNA (up to 3-fold). To our knowledge, variability in primer length has not been reported for this primase. We expect that applying HTPP to additional enzymes will reveal new insights into the effects of DNA sequence composition on the DNA recognition and functional activity of primases.

DNA double strand breaks are the most deleterious type of DNA damage. In this work, we show that SIRT6 directly recognizes DNA damage through a tunnel-like structure, with high affinity for double strand breaks. It relocates to sites of damage independently of signalling and known sensors and activates downstream signalling cascades for double strand break repair by triggering ATM recruitment, H2AX phosphorylation and the recruitment of proteins of the Homologous Recombination and Non-Homologous End Joining pathways. Our findings indicate that SIRT6 plays a previously uncharacterized role as DNA damage sensor, which is critical for initiating the DNA damage response (DDR). Moreover, other Sirtuins share some DSB binding capacity and DDR activation. SIRT6 activates the DDR, before pathway is chosen, and prevents genomic instability. Our findings place SIRT6 at the top of the DDR and pave the road to dissect the contributions of distinct double strand break sensors in downstream signalling.

Abstract M. tuberculosis ( Mtb ) is a pathogenic bacterium that causes tuberculosis, which kills more than 1.5 million people worldwide every year. Strains resistant to available antibiotics pose a significant healthcare problem. The enormous complexity of the ribosome poses a barrier for drug discovery. We have overcome this in a tractable way by using an RNA segment that represents the peptidyl transferase center as a target. By using a novel combination of NMR transverse relaxation times (T 2 ) and computational chemistry approaches, we have obtained improved inhibitors of the Mtb ribosomal PTC. Two phenylthiazole derivatives were predicted by machine learning models as effective inhibitors, and this was confirmed by their IC 50 values, which were significantly improved over standard antibiotic drugs.

ABSTRACT DNA-protein interactions are essential in all aspects of every living cell. Understanding of how features embedded in the DNA sequence affect specific interactions with proteins is challenging but important, since it may contribute to finding the means to regulate metabolic pathways involving DNA-protein interactions. Using a massive experimental benchmark dataset of binding scores for DNA sequences and a machine learning workflow, we describe the binding to DNA of T7 primase, as a model system for specific DNA-protein interactions. Effective binding of T7 primase to its specific DNA recognition sequences triggers the formation of RNA primers that serve as Okazaki fragment start sites during DNA replication.