Abstract Intracellular parasites of the phylum Apicomplexa are dependent on the scavenging of essential amino acids from their hosts. We previously identified a large family of apicomplexan-specific plasma membrane-localized amino acid transporters, the ApiATs, and showed that the Toxoplasma gondii transporter Tg ApiAT1 functions in the selective uptake of arginine. Tg ApiAT1 is essential for parasite virulence, but dispensable for parasite growth in medium containing high concentrations of arginine, indicating the presence of at least one other arginine transporter. Here we identify Tg ApiAT6-1 as the second arginine transporter. Using a combination of parasite assays and heterologous characterisation of Tg ApiAT6-1 in Xenopus laevis oocytes, we demonstrate that Tg ApiAT6-1 is a general cationic amino acid transporter that mediates both the high-affinity uptake of lysine and the low-affinity uptake of arginine. Tg ApiAT6-1 is the primary lysine transporter in the disease-causing tachyzoite stage of T. gondii and is essential for parasite proliferation. We demonstrate that the uptake of cationic amino acids by Tg ApiAT6-1 is ‘ trans -stimulated’ by cationic and neutral amino acids and is likely promoted by an inwardly negative membrane potential. These findings demonstrate that T. gondii has evolved overlapping transport mechanisms for the uptake of essential cationic amino acids, and we draw together our findings into a comprehensive model that highlights the finely-tuned, regulated processes that mediate cationic amino acid scavenging by these intracellular parasites. Author summary The causative agent of toxoplasmosis, Toxoplasma gondii , is a versatile intracellular parasite that can proliferate within nucleated cells of virtually all warm-blooded organisms. In order to survive, T. gondii must scavenge the cationic amino acids lysine and arginine from their hosts. In a previous study, we demonstrated that a plasma membrane-localized protein called Tg ApiAT1 facilitates the uptake of arginine into the parasite. We found that parasites lacking Tg ApiAT1 could proliferate when cultured in medium containing high concentrations of arginine, suggesting the existence of an additional uptake pathway for arginine. In the present study, we demonstrate that this second uptake pathway is mediated by Tg ApiAT6-1, a protein belonging to the same solute transporter family as Tg ApiAT1. We show that Tg ApiAT6-1 is the major lysine transporter of the parasite, and that it is critical for parasite proliferation. Furthermore, we demonstrate that Tg ApiAT6-1 can transport arginine into parasites in conditions where arginine concentrations are high and lysine concentrations are comparatively lower. These data support a model for the finely-tuned acquisition of essential cationic amino acids that involves multiple transporters, and which likely contributes to these parasites being able to survive and proliferate within a wide variety of host cell types.

Abstract With the advent of resistance to existing treatments, new drugs are needed to combat apicomplexan parasites such as the causative agents of malaria ( Plasmodium species) and toxoplasmosis ( Toxoplasma gondii ). To identify new inhibitors of the mitochondrial electron transport chain (ETC) in these parasites, we developed a Seahorse XFe96 flux analyzer approach to screen compounds from the Medicines for Malaria Venture ‘Pathogen Box’ for ETC inhibition. We identified six chemically diverse, on-target inhibitors of the ETC of T. gondii , five of which also target the ETC of Plasmodium falciparum . Two of the identified compounds (MMV024937 and MMV688853) represent novel ETC inhibitor chemotypes. We pinpoint the molecular targets of these inhibitors, demonstrating that all target ETC Complex III, with MMV688853 additionally targeting a kinase with a key role in parasite invasion of host cells. Most of the compounds remain effective inhibitors of parasites that are resistant to the clinically used Complex III inhibitor atovaquone. In sum, we have developed a versatile screening approach to identify and characterize new inhibitors of the ETC in apicomplexan parasites.

The mitochondrion of apicomplexan parasites is critical for parasite survival, although the full complement of proteins that localize to this organelle has not been defined. Here we undertake two independent approaches to elucidate the mitochondrial proteome of the apicomplexan Toxoplasma gondii. We identify 421 mitochondrial proteins, many of which lack homologs in the animals that these parasites infect, and most of which are important for parasite growth. We demonstrate that one such protein, termed TgApiCox25, is an important component of the parasite cytochrome c oxidase (COX) complex. We identify numerous other apicomplexan-specific components of COX, and conclude that apicomplexan COX, and apicomplexan mitochondria more generally, differ substantially in their protein composition from the hosts they infect. Our study highlights the diversity that exists in mitochondrial proteomes across the eukaryotic domain of life, and provides a foundation for defining unique aspects of mitochondrial biology in an important phylum of parasites.

The mitochondrial ATP synthase is a macromolecular motor that uses the proton gradient to generate ATP. Proper ATP synthase function requires a stator linking the catalytic and rotary portions of the complex. However, sequence-based searches fail to identify genes encoding stator subunits in apicomplexan parasites like Toxoplasma gondii or the related organisms that cause malaria. Here, we identify 11 previously unknown subunits from the Toxoplasma ATP synthase, which lack homologs outside the phylum. Hidden Markov modeling suggests that two of them (ICAP2 and ICAP18) share distant homology with mammalian stator subunits. Our analysis shows that both proteins form part of the ATP synthase complex. Depletion of ICAP2 leads to aberrant mitochondrial morphology, decreased oxygen consumption, and disassembly of the complex, consistent with its role as an essential component of the Toxoplasma ATP synthase. Our findings highlight divergent features of the central metabolic machinery in apicomplexans, which may reveal new therapeutic opportunities.

Intracellular parasites, such as the apicomplexan Toxoplasma gondii , are adept at scavenging nutrients from their host. However, there is little understanding of how parasites sense and respond to the changing nutrient environments they encounter during an infection. Tg ApiAT1, a member of the apicomplexan ApiAT family of amino acid transporters, is the major uptake route for the essential amino acid L-arginine (Arg) in T. gondii . Here, we show that the abundance of Tg ApiAT1, and hence the rate of uptake of Arg, is regulated by the availability of Arg in the parasite′s external environment, increasing in response to decreased [Arg]. Using a luciferase-based biosensor strain of T. gondii , we demonstrate that parasites vary the expression of Tg ApiAT1 in different organs within their host, indicating that parasites are able to modulate Tg ApiAT1-dependent uptake of Arg as they encounter different nutrient environments in vivo . Finally, we show that Arg-dependent regulation of Tg ApiAT1 expression is post-transcriptional, mediated by an upstream open reading frame (uORF) in the Tg ApiAT1 transcript, and we provide evidence that the peptide encoded by this uORF is critical for mediating regulation. Together, our data reveal the mechanism by which an apicomplexan parasite responds to changes in the availability of a key nutrient.

Apicomplexan parasites are auxotrophic for a range of amino acids which must be salvaged from their host cells, either through direct uptake or degradation of host proteins. Here, we describe a family of plasma membrane-localized amino acid transporters, termed the Apicomplexan Amino acid Transporters (ApiATs), that are common to apicomplexan parasites. Functional characterization of the ApiATs of Toxoplasma gondii indicate that several of these transporters are important for intracellular growth of the tachyzoite stage, which is associated with acute infections. In particular, we demonstrate that one such ApiAT protein, which we term TgApiAT5-3, is an exchanger for aromatic and large neutral amino acids that functions in L-tyrosine scavenging and amino acid homeostasis, and is important for parasite virulence. We also provide evidence for the existence of alternative aromatic amino acid uptake pathways in the parasite, and present a model for the uptake and homeostasis of these amino acids. Our findings identify a family of amino acid transporters in apicomplexans, and highlight the importance of amino acid scavenging for the biology of this important phylum of intracellular parasites.

Abstract The mitochondrion is critical for the survival of apicomplexan parasites. Several major anti-parasitic drugs, such as atovaquone and endochin-like quinolones, act through inhibition of the mitochondrial electron transport chain at the coenzyme Q:cytochrome c oxidoreductase complex (Complex III). Despite being an important drug target, the protein composition of Complex III of apicomplexan parasites has not been elucidated. Here, we undertake a mass spectrometry-based proteomic analysis of Complex III in the apicomplexan Toxoplasma gondii . Along with canonical subunits that are conserved across eukaryotic evolution, we identify several novel or highly divergent Complex III components that are conserved within the apicomplexan lineage. We demonstrate that one such subunit, which we term Tg QCR11, is critical for parasite proliferation, mitochondrial oxygen consumption and Complex III activity, and establish that loss of this protein leads to defects in Complex III integrity. We conclude that the protein composition of Complex III in apicomplexans differs from that of the mammalian hosts that these parasites infect. Author summary Apicomplexan parasites cause numerous diseases in humans and animals, including malaria ( Plasmodium species) and toxoplasmosis ( Toxoplasma gondii ). The coenzyme Q:cytochrome c oxidoreductase protein complex (Complex III) performs a central role in the mitochondrial electron transport chain of many eukaryotes. Despite being the target of several major anti-apicomplexan drugs, the protein composition of Complex III in apicomplexans was previously unknown. Our work identifies novel proteins in Complex III of apicomplexans, one of which is critical for complex function and integrity. Our study highlights divergent features of Complex III in apicomplexans, and provides a broader understanding of Complex III evolution in eukaryotes. Our study also provides important insights into what sets this major drug target apart from the equivalent complex in host species.