Background— The failing human heart is characterized by metabolic abnormalities, but these defects remains incompletely understood. In animal models of heart failure there is a switch from a predominance of fatty acid utilization to the more oxygen-sparing carbohydrate metabolism. Recent studies have reported decreases in myocardial lipid content, but the inclusion of diabetic and nondiabetic patients obscures the distinction of adaptations to metabolic derangements from adaptations to heart failure per se. Methods and Results— We performed both unbiased and targeted myocardial lipid surveys using liquid chromatography-mass spectroscopy in nondiabetic, lean, predominantly nonischemic, advanced heart failure patients at the time of heart transplantation or left ventricular assist device implantation. We identified significantly decreased concentrations of the majority of myocardial lipid intermediates, including long-chain acylcarnitines, the primary subset of energetic lipid substrate for mitochondrial fatty acid oxidation. We report for the first time significantly reduced levels of intermediate and anaplerotic acyl-coenzyme A (CoA) species incorporated into the Krebs cycle, whereas the myocardial concentration of acetyl-CoA was significantly increased in end-stage heart failure. In contrast, we observed an increased abundance of ketogenic β-hydroxybutyryl-CoA, in association with increased myocardial utilization of β-hydroxybutyrate. We observed a significant increase in the expression of the gene encoding succinyl-CoA:3-oxoacid-CoA transferase, the rate-limiting enzyme for myocardial oxidation of β-hydroxybutyrate and acetoacetate. Conclusions— These findings indicate increased ketone utilization in the severely failing human heart independent of diabetes mellitus, and they support the role of ketone bodies as an alternative fuel and myocardial ketone oxidation as a key metabolic adaptation in the failing human heart.

Fibrosis is observed in nearly every form of myocardial disease1. Upon injury, cardiac fibroblasts in the heart begin to remodel the myocardium by depositing excess extracellular matrix, resulting in increased stiffness and reduced compliance of the tissue. Excessive cardiac fibrosis is an important factor in the progression of various forms of cardiac disease and heart failure2. However, clinical interventions and therapies that target fibrosis remain limited3. Here we demonstrate the efficacy of redirected T cell immunotherapy to specifically target pathological cardiac fibrosis in mice. We find that cardiac fibroblasts that express a xenogeneic antigen can be effectively targeted and ablated by adoptive transfer of antigen-specific CD8+ T cells. Through expression analysis of the gene signatures of cardiac fibroblasts obtained from healthy and diseased human hearts, we identify an endogenous target of cardiac fibroblasts—fibroblast activation protein. Adoptive transfer of T cells that express a chimeric antigen receptor against fibroblast activation protein results in a significant reduction in cardiac fibrosis and restoration of function after injury in mice. These results provide proof-of-principle for the development of immunotherapeutic drugs for the treatment of cardiac disease. Adoptive transfer of CAR T cells against the fibroblast marker FAP reduces cardiac fibrosis and restores function after cardiac injury in mice, providing proof-of-principle for the development of immunotherapeutic treatments for cardiac disease.

The human heart requires a complex ensemble of specialized cell types to perform its essential function. A greater knowledge of the intricate cellular milieu of the heart is critical to increase our understanding of cardiac homeostasis and pathology. As recent advances in low-input RNA sequencing have allowed definitions of cellular transcriptomes at single-cell resolution at scale, we have applied these approaches to assess the cellular and transcriptional diversity of the nonfailing human heart.Microfluidic encapsulation and barcoding was used to perform single nuclear RNA sequencing with samples from 7 human donors, selected for their absence of overt cardiac disease. Individual nuclear transcriptomes were then clustered based on transcriptional profiles of highly variable genes. These clusters were used as the basis for between-chamber and between-sex differential gene expression analyses and intersection with genetic and pharmacologic data.We sequenced the transcriptomes of 287 269 single cardiac nuclei, revealing 9 major cell types and 20 subclusters of cell types within the human heart. Cellular subclasses include 2 distinct groups of resident macrophages, 4 endothelial subtypes, and 2 fibroblast subsets. Comparisons of cellular transcriptomes by cardiac chamber or sex reveal diversity not only in cardiomyocyte transcriptional programs but also in subtypes involved in extracellular matrix remodeling and vascularization. Using genetic association data, we identified strong enrichment for the role of cell subtypes in cardiac traits and diseases. Intersection of our data set with genes on cardiac clinical testing panels and the druggable genome reveals striking patterns of cellular specificity.Using large-scale single nuclei RNA sequencing, we defined the transcriptional and cellular diversity in the normal human heart. Our identification of discrete cell subtypes and differentially expressed genes within the heart will ultimately facilitate the development of new therapeutics for cardiovascular diseases.

Summary Quantitative sub-cellular metabolomic measurements can yield crucial insights into the roles of metabolites in cellular processes, but are subject to multiple confounding factors. We developed S table I sotope L abeling of E ssential nutrients in cell C ulture – S ub-cellular F ractionation (SILEC-SF), which uses isotope labeled internal standard controls that are present throughout fractionation and processing to quantify acyl-Coenzyme A thioesters in sub-cellular compartments by liquid chromatography-mass spectrometry. We tested SILEC-SF in a range of sample types and examined the compartmentalized responses to oxygen tension, cellular differentiation, and nutrient availability. Application of SILEC-SF to the challenging analysis of the nuclear compartment revealed a nuclear acyl-CoA profile distinct from that of the cytosol, with notable nuclear enrichment of propionyl-CoA. Using isotope tracing we identified the branched chain amino acid (BCAA) isoleucine as a major metabolic source of nuclear propionyl-CoA and histone propionylation, thus revealing a new mechanism of crosstalk between metabolism and the epigenome.

Differentiation of cardiac fibroblasts to myofibroblasts is necessary for matrix remodeling and fibrosis in heart failure. We previously reported that mitochondrial calcium signaling drives α-ketoglutarate-dependent histone demethylation, promoting myofibroblast formation. Here we investigate the role of ATP-citrate lyase (ACLY), a key enzyme for acetyl-CoA biosynthesis, in histone acetylation regulating myofibroblast fate and persistence in cardiac fibrosis. We show that inactivation of ACLY prevents myofibroblast differentiation and reverses myofibroblasts towards quiescence. Genetic deletion of Acly in post-activated myofibroblasts prevents fibrosis and preserves cardiac function in pressure-overload heart failure. TGFβ stimulation enhances ACLY nuclear localization and ACLY-SMAD2/3 interaction, and increases H3K27ac at fibrotic gene loci. Pharmacological inhibition of ACLY or forced nuclear expression of a dominant-negative ACLY mutant prevents myofibroblast formation and H3K27ac. Our data indicate that nuclear ACLY activity is necessary for myofibroblast differentiation and persistence by maintaining histone acetylation at TGFβ-induced myofibroblast genes. These findings provide targets to prevent and reverse pathological fibrosis.

Abstract Inhibitors of sodium glucose cotransporter-2 (SGLT2i) demonstrate strong symptomatic and mortality benefits in the treatment of heart failure but appear to do so independently of SGLT2. The relevant pharmacologic target of SGLT2i remains unclear. We show here that SGLT2i directly activate pantothenate kinase 1 (PANK1), the rate-limiting enzyme that initiates the conversion of pantothenate (vitamin B5) to coenzyme-A (CoA), an obligate co-factor for all major pathways of fuel use in the heart. Using stable-isotope infusion studies, we show that SGLT2i promote pantothenate consumption, activate CoA synthesis, rescue decreased levels of CoA in human failing hearts, and broadly stimulate fuel use in ex vivo perfused human cardiac blocks from patients with heart failure. Furthermore, we show that SGLT2i bind to PANK1 directly at physiological concentrations and promote PANK1 enzymatic activity in assays with purified components. Novel in silico dynamic modeling identified the site of SGLT2i binding on PANK1 and indicated a mechanism of activation involving prevention of allosteric inhibition of PANK1 by acyl-CoA species. Finally, we show that inhibition of PANK1 prevents SGLT2i-mediated increased contractility of isolated adult human cardiomyocytes. In summary, we demonstrate robust and specific off-target activation of PANK1 by SGLT2i, promoting CoA synthesis and efficient fuel use in human hearts, providing a likely explanation for the remarkable clinical benefits of SGLT2i.

Heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) is a complex syndrome associated with increased myocardial stiffness and cardiac filling abnormalities. Prior studies implicated increased α-tubulin detyrosination, which is catalyzed by the vasohibin enzymes, as a contributor to increased stabilization of the cardiomyocyte microtubule network (MTN) and stiffness in failing human hearts. We explored whether increased MTN detyrosination contributed to impaired diastolic function in the ZSF1 obese rat model of HFpEF and designed a small-molecule vasohibin inhibitor to ablate MTN detyrosination in vivo. Compared with ZSF1 lean and Wistar Kyoto rats, obese rats exhibited increased tubulin detyrosination concomitant with diastolic dysfunction, left atrial enlargement, and cardiac hypertrophy with a preserved left ventricle ejection fraction, consistent with an HFpEF phenotype. Ex vivo myocardial phenotyping assessed cardiomyocyte mechanics and contractility. Vasohibin inhibitor treatment of isolated cardiomyocytes from obese rats resulted in reduced stiffness and faster relaxation. Acute in vivo treatment with vasohibin inhibitor improved diastolic relaxation in ZSF1 obese rats compared with ZSF1 lean and Wistar Kyoto rats. Vasohibin inhibition also improved relaxation in isolated human cardiomyocytes from both failing and nonfailing hearts. Our data suggest the therapeutic potential for vasohibin inhibition to reduce myocardial stiffness and improve relaxation in HFpEF.

Abstract A proliferated and post-translationally modified microtubule network underlies cellular growth in cardiac hypertrophy and contributes to contractile dysfunction in heart failure. Yet how the heart achieves this modified network is poorly understood. Determining how the “tubulin code” – the permutations of tubulin isoforms and post-translational modifications - is rewritten upon cardiac stress may provide new targets to modulate cardiac remodeling. Further, while tubulin can autoregulate its own expression, it is unknown if autoregulation is operant in the heart or tuned in response to stress. Here we use heart failure patient samples and murine models of cardiac remodeling to interrogate transcriptional, autoregulatory, and post-translational mechanisms that contribute to microtubule network remodeling at different stages of heart disease. We find that autoregulation is operant across tubulin isoforms in the heart and leads to an apparent disconnect in tubulin mRNA and protein levels in heart failure. We also find that within 4 hours of a hypertrophic stimulus and prior to cardiac growth, microtubule detyrosination is rapidly induced to help stabilize the network. This occurs concomitant with rapid transcriptional and autoregulatory activation of specific tubulin isoforms and microtubule motors. Upon continued hypertrophic stimulation, there is an increase in post-translationally modified microtubule tracks and anterograde motors to support cardiac growth, while total tubulin content increases through progressive transcriptional and autoregulatory induction of tubulin isoforms. Our work provides a new model for how the tubulin code is rapidly rewritten to establish a proliferated, stable microtubule network that drives cardiac remodeling, and provides the first evidence of tunable tubulin autoregulation during pathological progression.

Summary DNA damage causes genomic instability underlying many human diseases. Traditional approaches to DNA damage analysis provide minimal insights into the spectrum of disease-driving DNA lesions and the mechanisms causing imbalances in damage formation and repair. Here we used untargeted mass spectrometry-based adductomics 1 to discover 114 putative DNA lesions and modifications consistently detected in humans and two independent analyses in rats, showing species-, tissue-, age-, and sex-biases. As evidence of methodologic rigor, 10 selected adductomic signals were structurally validated as epigenetic marks: 5-MdC, 5-HMdC, 5-FdC; DNA damage products: N 2 -CMdG, 1, N 6 ε-dA, 3, N 4 -εdC, M 1 dG, O 6/ N 2 -MdG, and 8-Oxo-dG; and established analytical artifacts: cyclobutane dimers of 2’-deoxycytosine. With steady-state levels of putative DNA adducts integrating multiple cell types in each tissue, there was strong age-dependent variation for many putative adducts, including N 2 -CMdG, 5-HMdC, and 8-Oxo-dG in rats and 1, N 6 ε-dA in human heart, as well as sex biases for 67 putative adducts in rat tissues. These results demonstrate the potential of untargeted adductomic analysis for defining DNA adducts as disease determinants, assigning substrates to DNA repair pathways, discovering new metabolically-driven DNA lesions, and quantifying inter-individual variation in DNA damage and repair across populations.