Background: Metabolic reprograming, non-mutational epigenetic changes, increased cell plasticity and multidrug tolerance are early hallmarks of therapy resistance in cancer. In this temporary, therapy-tolerant state, cancer cells are highly sensitive to ferroptosis, a form of regulated cell death that is caused by oxidative stress through excess levels of iron-dependent peroxidation of polyunsaturated fatty acids (PUFA). However, mechanisms underpinning therapy-induced ferroptosis hypersensitivity remain to be elucidated. Methods: We used quantitative single cell imaging of fluorescent metabolic probes, transcriptomics, proteomics and lipidomics to perform a longitudinal analysis of the adaptive response to androgen receptor-targeted therapies (androgen deprivation and enzalutamide) in prostate cancer (PCa). Results: We discovered that cessation of cell proliferation and a robust reduction in bioenergetic processes were associated with multidrug tolerance and a strong accumulation of lipids. The gain in lipid biomass was fueled by enhanced lipid uptake through cargo non-selective (macropinocytosis, tunneling nanotubes) and cargo-selective mechanisms (lipid transporters), whereas de novo lipid synthesis was strongly reduced. Enzalutamide induced extensive lipid remodeling of all major phospholipid classes at the expense of storage lipids, leading to increased desaturation and acyl chain length of membrane lipids. The rise in membrane PUFA levels enhanced membrane fluidity and lipid peroxidation, causing hypersensitivity to glutathione peroxidase (GPX4) inhibition and ferroptosis. Combination treatments against AR and fatty acid desaturation, lipase activities or growth medium supplementation with antioxidants or PUFAs altered GPX4 dependence. Despite multidrug tolerance, PCa cells displayed an enhanced sensitivity to inhibition of lysosomal processing of exogenous lipids, highlighting an increased dependence on lipid uptake in the therapy-tolerant state. Conclusions: Our work provides mechanistic insight into processes of lipid metabolism that underpin the acquisition of therapy-induced GPX4 dependence and ferroptosis hypersensitivity to standard of care therapies in PCa. It demonstrated novel strategies to suppress the therapy-tolerant state that may have potential to delay and combat resistance to androgen receptor-targeted therapies, a currently unmet clinical challenge of advanced PCa. Since enhanced GPX4 dependence is an adaptive phenotype shared by several types of cancer in response to different therapies, our work might have universal implications for our understanding of metabolic events that underpin resistance to cancer therapies.

Abstract Fatty acid (FA) modifications, such as enzymatic desaturation and elongation, have long been thought to involve sequential and highly specific enzyme-substrate interactions, which result in canonical products that are well-defined in their chain lengths, degree of unsaturation and double bond positions. 1 These products act as a supply of building blocks for the synthesis of complex lipids supporting a symphony of lipid signals and membrane macrostructure. Recently, it was brought to light that differences in substrate availability due to enzyme inhibition can activate alternative pathways in a range of cancers, potentially altering the total species repertoire of FA metabolism. 2,3 We have used isomer-resolved lipidomics to analyse human prostate tumours and cancer cell lines and reveal, for the first-time, the full extent of metabolic plasticity in cancer. Assigning the double bond position(s) in simple and complex lipids allows mapping of fatty acid desaturation and elongation via hitherto apocryphal metabolic pathways that generate FAs with unusual sites of unsaturation. Downstream utilisation of these FAs is demonstrated by their incorporation into complex structural lipids. The unsaturation profiles of different phospholipids reveal substantive structural variation between classes that will, necessarily, modulate lipid-centred biological processes in cancer cells including membrane fluidity 3-5 and signal transduction. 6-8

1.0 Summary Cellular energy and biomass demands of cancer drive a complex dynamic between uptake of extracellular fatty acids (FA) and de novo synthesis. Given that oxidation of de novo synthesised FAs for energy would result in net-energy loss, there is an implication that FAs from these two sources must have distinct metabolic fates - however hitherto FAs were considered part of a common pool. To probe FA metabolic partitioning, cancer cells were supplemented with stable-isotope labelled FAs. Structural analysis of the resulting glycerophospholipids revealed that labelled FAs from uptake were largely incorporated to canonical ( sn -)positions on the glycerol backbone. Surprisingly, labelled FA uptake disrupted canonical isomer patterns of the unlabelled lipidome and induced repartitioning of n -3 and n -6 polyunsaturated-FAs into glycerophospholipid classes. These structural changes evidence differences in the metabolic fate of FAs derived from uptake or de novo sources and demonstrate unique signalling and remodelling behaviours usually hidden to conventional lipidomics. Highlights Lipid isomers reveal discrete metabolic compartmentalisation in cancer FAs derived from uptake and de novo synthesis have different metabolic fates Stearate uptake signals for PUFA ( n -3 and n -6) repartitioning between lipid classes sn -positional isomers are a marker for aberrant lipid metabolism