Most cancers are diagnosed in persons over the age of sixty, but little is known about how age impacts tumorigenesis. While aging is accompanied by mutation accumulation - widely understood to contribute to cancer risk - it is also associated with numerous other cellular and molecular changes likely to impact tumorigenesis. Moreover, cancer incidence decreases in the oldest part of the population, suggesting that very old age may reduce carcinogenesis. Here we show that aging represses tumor initiation and growth in genetically engineered mouse models of human lung cancer. Moreover, aging dampens the impact of inactivating many, but not all, tumor suppressor genes with the impact of inactivating PTEN, a negative regulator of the PI3K/AKT pathway, weakened to a disproportionate extent. Single-cell transcriptomic analysis revealed that neoplastic cells from tumors in old mice retain many age-related transcriptomic changes, showing that age has an enduring impact that persists through oncogenic transformation. Furthermore, the consequences of PTEN inactivation were strikingly age-dependent, with PTEN deficiency reducing signatures of aging in cancer cells and the tumor microenvironment. Our findings suggest that the relationship between age and lung cancer incidence may reflect an integration of the competing effects of driver mutation accumulation and tumor suppressive effects of aging.

ABSTRACT Oncogenic KRAS mutations occur in approximately 30% of lung adenocarcinoma. Despite several decades of effort, oncogenic KRAS-driven lung cancer remains difficult to treat, and our understanding of the positive and negative regulators of RAS signaling is incomplete. To uncover the functional impact of diverse KRAS-interacting proteins on lung cancer growth in vivo , we used multiplexed somatic CRISPR/Cas9-based genome editing in genetically engineered mouse models with tumor barcoding and high-throughput barcode sequencing. Through a series of CRISPR/Cas9 screens in autochthonous lung tumors, we identified HRAS and NRAS as key suppressors of KRAS G12D -driven tumor growth in vivo and confirmed these effects in oncogenic KRAS-driven human lung cancer cell lines. Mechanistically, RAS paralogs interact with oncogenic KRAS, suppress KRAS-KRAS interactions, and reduce downstream ERK signaling. HRAS mutations identified in KRAS-driven human tumors partially abolished this effect. Comparison of the tumor-suppressive effects of HRAS and NRAS in KRAS- and BRAF-driven lung cancer models confirmed that RAS paralogs are specific suppressors of oncogenic KRAS-driven lung cancer in vivo . Our study outlines a technological avenue to uncover positive and negative regulators of oncogenic KRAS-driven cancer in a multiplexed manner in vivo and highlights the role of RAS paralog imbalance in oncogenic KRAS-driven lung cancer.

ABSTRACT Lung cancer is the leading cause of cancer death worldwide, with lung adenocarcinoma being the most common subtype. Many oncogenes and tumor suppressor genes are altered in this cancer type and the discovery of oncogene mutations has led to the development of targeted therapies that have improved clinical outcomes. However, a large fraction of lung adenocarcinomas lacks mutations in known oncogenes, and the genesis and treatment of these oncogene-negative tumors remain enigmatic. Here, we perform iterative in vivo functional screens using quantitative autochthonous mouse model systems to uncover the genetic and biochemical changes that enable efficient lung tumor initiation in the absence of oncogene alterations. Through the generation of hundreds of diverse combinations of tumor suppressor alterations, we demonstrate that the inactivation of suppressors of the RAS and PI3K pathways drive the development of oncogene-negative lung adenocarcinoma. Human genomic data and histology identified RAS/MAPK and PI3K pathway activation as a common event in oncogene- negative human lung adenocarcinomas. We demonstrate that these Onc-negative RAS/PI3K tumors and related cell lines are vulnerable to pharmacological inhibition of these signaling axes. These results transform our understanding of this prevalent yet understudied subtype of lung adenocarcinoma.

ABSTRACT Cell-cell interactions influence all aspects of development, homeostasis, and disease. In cancer, interactions between cancer cells and stromal cells play a major role in nearly every step of carcinogenesis. Thus, the ability to record cell-cell interactions would facilitate mechanistic delineation of the role of cancer microenvironment. Here, we describe GFP-based Touching Nexus (G-baToN) which relies upon nanobody-directed fluorescent protein transfer to enable sensitive and specific labeling of cells after cell-cell interactions. G-baToN is a generalizable system that enables physical contact-based labeling between various cell types, including diverse cancer-stromal cell pairs. A suite of orthogonal baToN tools enables reciprocal cell-cell labeling, interaction-dependent cargo transfer, and the identification of higher-order cell-cell interactions across a wide range of cell types. The ability to track physically interacting cells with these simple and sensitive systems will greatly accelerate our understanding of the outputs of cell-cell interactions in cancer as well as across many biological processes.

ABSTRACT Small cell lung cancer (SCLC) is a highly lethal form of lung cancer. The high mutation burden in SCLC cells makes it challenging to predict key drivers of SCLC from genome sequencing data, thereby hindering the identification of possible therapeutic targets. Here we develop a quantitative multiplexed approach based on lentiviral barcoding with somatic CRISPR/Cas9-mediated genome editing to functionally investigate candidate regulators of tumor initiation and growth in genetically engineered mouse models of SCLC. Lentiviral vector-mediated SCLC initiation was greatly enhanced by naphthalene pre-treatment, enabling high multiplicity of tumor clones for analysis through high-throughput sequencing methods. Based on a meta-analysis across multiple human SCLC genomic datasets, we quantified the impact of inactivating 39 genes across many candidate pathways and captured both positive and detrimental effects on SCLC initiation and progression upon gene inactivation. This analysis and subsequent validation in human SCLC cells identified TSC1 in the PI3K-AKT-mTOR pathway as a robust tumor suppressor in SCLC. This new approach should illuminate novel drivers of SCLC, facilitate the development of precision therapies for defined SCLC genotypes, and identify new therapeutic targets.

The lack of knowledge about the relationship between tumor genotypes and therapeutic responses remains one of the most important gaps in enabling the effective use of cancer therapies. Here, we couple a multiplexed and quantitative platform with robust statistical methods to enable pharmacogenomic mapping of lung cancer treatment responses in vivo. We uncover a surprisingly complex map of genotype-specific therapeutic responses, with over 20% of possible interactions showing significant resistance or sensitivity. We validate one of these interactions - the resistance of Keap1 mutant tumors to platinum therapy - using a large patient response dataset. Our results highlight the importance of understanding the genetic determinants of treatment responses in the development of precision therapies and define a strategy to identify such determinants.

The cohesin complex is a critical regulator of gene expression. STAG2 is the most frequently mutated cohesin subunit across several cancer types and is a key tumor suppressor in lung cancer. Here, we coupled somatic CRISPR-Cas9 genome editing and tumor barcoding with an autochthonous oncogenic KRAS-driven lung cancer model and showed that STAG2 is uniquely tumor-suppressive among all core and auxiliary cohesin components. The heterodimeric complex components PAXIP1 and PAGR1 have highly correlated effects with STAG2 in human lung cancer cell lines, are tumor suppressors in vivo, and are epistatic to STAG2 in oncogenic KRAS-driven lung tumorigenesis in vivo. STAG2 inactivation elicits changes in gene expression, chromatin accessibility, and 3D genome conformation that impact the cancer cell state. Gene expression and chromatin accessibility similarities between STAG2- and PAXIP1-deficient neoplastic cells further relate STAG2-cohesin to PAXIP1/PAGR1. These findings reveal a STAG2-PAXIP1/PAGR1 tumor-suppressive axis and uncover novel PAXIP1-dependent and PAXIP1-independent STAG2-cohesin-mediated mechanisms of lung tumor suppression.

Metastasis is the main cause of death in cancer patients but remains a poorly understood process. Small cell lung cancer (SCLC) is one of the most lethal and most metastatic types of human cancer. SCLC cells normally express neuroendocrine and neuronal gene programs but accumulating evidence indicates that these cancer cells become relatively more neuronal and less neuroendocrine as they gain the ability to metastasize. Here we show that mouse and human SCLC cells in culture and in vivo can grow cellular protrusions that resemble axons. The formation of these protrusions is controlled by multiple neuronal factors implicated in axonogenesis, axon guidance, and neuroblast migration. Disruption of these axon-like protrusions impairs cell migration in culture and inhibits metastatic ability in vivo. The co-option of developmental neuronal programs is a novel molecular and cellular mechanism that contributes to the high metastatic ability of SCLC.

Cancer genome sequencing has uncovered substantial complexity in the mutational landscape of tumors. Given this complexity, experimental approaches are necessary to establish the impact of combinations of genetic alterations on tumor biology and to uncover genotype-dependent effects on drug sensitivity. In lung adenocarcinoma, EGFR mutations co-occur with many putative tumor suppressor gene alterations, however the extent to which these alterations contribute to tumor growth and their response to therapy in vivo has not been explored experimentally. By integrating a novel mouse model of oncogenic EGFR -driven Trp53 -deficient lung adenocarcinoma with multiplexed CRISPR– Cas9 -mediated genome editing and tumor barcode sequencing, we quantified the effects of inactivation of ten putative tumor suppressor genes. Inactivation of Apc , Rb1 , or Rbm10 most strongly promoted tumor growth. Unexpectedly, inactivation of Lkb1 or Setd2 – which were the strongest drivers of tumor growth in an oncogenic Kras -driven model – reduced EGFR -driven tumors growth. These results were consistent with the relative frequency of these tumor suppressor gene alterations in human EGFR - and KRAS -driven lung adenocarcinomas. Furthermore, Keap1 inactivation reduced the sensitivity of tumors to osimertinib in the EGFRL858R ; p53 flox/flox model. Importantly, in human EGFR / TP53 mutant lung adenocarcinomas, mutations in the KEAP1 pathway correlated with decreased time on tyrosine kinase inhibitor treatment. Our study highlights how genetic alterations can have dramatically different biological consequences depending on the oncogenic context and that the fitness landscape can shift upon drug treatment.### Competing Interest StatementK.Politi is co-inventor on a patent licensed to Molecular MD for EGFR T790M mutation testing (through MSKCC). K.Politi has received Honoraria/Consulting fees from Takeda, NCCN, Novartis, Merck, AstraZeneca, Tocagen, Maverick Therapeutics and Dynamo Therapeutics and research support from AstraZeneca, Kolltan, Roche and Symphogen. M. M. Winslow has received honoraria from the speakers bureaus of Genentech, Merck, and Amgen. M. M. Winslow and D. Petrov have ownership interest (including stock, patents, etc.) in D2G Oncology and are a consultant/advisory board members for D2G Oncology. M. Diehn reports research funding from Varian Medical Systems and Illumina, ownership interest in CiberMed, patent filings related to cancer biomarkers, paid consultancy from Roche, AstraZeneca, and BioNTech, and travel/honoraria from RefleXion and Illumina.