Although the functions of a few effector proteins produced by bacterial and oomycete plant pathogens have been elucidated in recent years, information for the vast majority of pathogen effectors is still lacking, particularly for those of plant-pathogenic fungi. Here, we show that the avirulence effector AvrPiz-t from the rice blast fungus Magnaporthe oryzae preferentially accumulates in the specialized structure called the biotrophic interfacial complex and is then translocated into rice (Oryza sativa) cells. Ectopic expression of AvrPiz-t in transgenic rice suppresses the flg22- and chitin-induced generation of reactive oxygen species (ROS) and enhances susceptibility to M. oryzae, indicating that AvrPiz-t functions to suppress pathogen-associated molecular pattern (PAMP)-triggered immunity in rice. Interaction assays show that AvrPiz-t suppresses the ubiquitin ligase activity of the rice RING E3 ubiquitin ligase APIP6 and that, in return, APIP6 ubiquitinates AvrPiz-t in vitro. Interestingly, agroinfection assays reveal that AvrPiz-t and AvrPiz-t Interacting Protein 6 (APIP6) are both degraded when coexpressed in Nicotiana benthamiana. Silencing of APIP6 in transgenic rice leads to a significant reduction of flg22-induced ROS generation, suppression of defense-related gene expression, and enhanced susceptibility of rice plants to M. oryzae. Taken together, our results reveal a mechanism in which a fungal effector targets the host ubiquitin proteasome system for the suppression of PAMP-triggered immunity in plants.

Abstract Knowledge remains limited about how fungal pathogens that colonize living plant cells translocate effector proteins inside host cells to regulate cellular processes and neutralize defense responses. To cause the globally important rice blast disease, specialized invasive hyphae (IH) invade successive living rice (Oryza sativa) cells while enclosed in host-derived extrainvasive hyphal membrane. Using live-cell imaging, we identified a highly localized structure, the biotrophic interfacial complex (BIC), which accumulates fluorescently labeled effectors secreted by IH. In each newly entered rice cell, effectors were first secreted into BICs at the tips of the initially filamentous hyphae in the cell. These tip BICs were left behind beside the first-differentiated bulbous IH cells as the fungus continued to colonize the host cell. Fluorescence recovery after photobleaching experiments showed that the effector protein PWL2 (for prevents pathogenicity toward weeping lovegrass [Eragrostis curvula]) continued to accumulate in BICs after IH were growing elsewhere. PWL2 and BAS1 (for biotrophy-associated secreted protein 1), BIC-localized secreted proteins, were translocated into the rice cytoplasm. By contrast, BAS4, which uniformly outlines the IH, was not translocated into the host cytoplasm. Fluorescent PWL2 and BAS1 proteins that reached the rice cytoplasm moved into uninvaded neighbors, presumably preparing host cells before invasion. We report robust assays for elucidating the molecular mechanisms that underpin effector secretion into BICs, translocation to the rice cytoplasm, and cell-to-cell movement in rice.

Abstract Biotrophic invasive hyphae (IH) of the blast fungus Magnaporthe oryzae secrete effectors to alter host defenses and cellular processes as they successively invade living rice (Oryza sativa) cells. However, few blast effectors have been identified. Indeed, understanding fungal and rice genes contributing to biotrophic invasion has been difficult because so few plant cells have encountered IH at the earliest infection stages. We developed a robust procedure for isolating infected-rice sheath RNAs in which ∼20% of the RNA originated from IH in first-invaded cells. We analyzed these IH RNAs relative to control mycelial RNAs using M. oryzae oligoarrays. With a 10-fold differential expression threshold, we identified known effector PWL2 and 58 candidate effectors. Four of these candidates were confirmed to be fungal biotrophy-associated secreted (BAS) proteins. Fluorescently labeled BAS proteins were secreted into rice cells in distinct patterns in compatible, but not in incompatible, interactions. BAS1 and BAS2 proteins preferentially accumulated in biotrophic interfacial complexes along with known avirulence effectors, BAS3 showed additional localization near cell wall crossing points, and BAS4 uniformly outlined growing IH. Analysis of the same infected-tissue RNAs with rice oligoarrays identified putative effector-induced rice susceptibility genes, which are highly enriched for sensor-transduction components rather than typically identified defense response genes.

Abstract The blast fungus, Magnaporthe oryzae , causes severe destruction to rice and other crops worldwide. As the fungus infects rice, it develops unique cellular structures, such as an appressorium and a narrow penetration peg, to permit successful invasion of host rice cells. Fundamental knowledge about these cellular structures and how organelles, such as the nucleus, are positioned within them is still emerging. Previous studies show that a single nucleus becomes highly stretched during movement through the narrow penetration peg in an extreme nuclear migration event. Yet, the mechanism permitting this nuclear migration event remains elusive. Here, we investigate the role of the mitotic spindle in mediating nuclear migration through the penetration peg. We find that disruption of spindle function during nuclear migration through the penetration peg prevents development of invasive hyphae and virulence on rice. Furthermore, regulated expression of conserved kinesin motor proteins, MoKin5 and MoKin14, is essential to form and maintain the spindle, as well as, properly nucleate the primary hypha. Overexpression of MoKin5 leads to formation of aberrant microtubule protrusions, which contributes to formation of nuclear fragments within the appressorium and primary hypha. Conversely, overexpression of MoKin14 causes the spindle to collapse leading to the formation of monopolar spindles. These results establish a mechanistic model towards understanding the intricate subcellular dynamics of extreme nuclear migration through the penetration peg, a critical step in the development of rice blast disease. Importance Magnaporthe oryzae , also known as the blast fungus, is a formidable hinderance to global food production, including rice. The destructive fungal pathogen develops highly-specialized cells and structures, such as appressoria and penetration pegs, to permit successful invasion of rice cells. Our understanding of M. oryzae’s fundamental biology during host cell invasion and colonization is still developing. For instance, it is not yet known how organelles, such as the nucleus, migrate through the narrow penetration peg. Moreover, few previous studies examine the role of motor proteins in M. oryzae. In this study, we determined that the mitotic spindle propels a single nucleus through the penetration peg to permit successful development of fungal hyphae inside the first-invaded rice cell. We also identified two conserved kinesin motor proteins, MoKin5 and MoKin14. Our analyses suggested that MoKin5 and MoKin14 exhibit canonical functions in M. oryzae during rice infection. This study addressed long-standing questions in rice blast biology, and our results offer opportunities for future research.

Structured Illumination Microscopy enables live imaging with resolutions of ~120 nm. Unfortunately, optical aberrations can lead to loss of resolution and artifacts in Structured Illumination Microscopy rendering the technique unusable in samples thicker than a single cell. Here we report on the combination of Adaptive Optics and Structured Illumination Microscopy enabling imaging with 140 nm lateral and 585 nm axial resolution in tissue culture cells, C. elegans, and rice blast fungus. We demonstrate that AO improves resolution and reduces artifacts, making full 3D SIM possible in thicker samples.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

ABSTRACT Rice blast disease caused by Magnaporthe oryzae is a devastating disease of cultivated rice worldwide. Infections by this fungus lead to a significant reduction in rice yields and threats to food security. To gain better insight into growth and cell death in M. oryzae during infection, we characterized two predicted M. oryzae metacaspase proteins, MoMca1 and MoMca2. These proteins appear to be functionally redundant and are able to complement the yeast Yca1 homologue. Biochemical analysis revealed that M. oryzae metacaspases exhibited Ca 2+ dependent caspase activity in vitro . Deletion of both MoMca1 and MoMca2 in M. oryzae resulted in reduced sporulation, delay in conidial germination and attenuation of disease severity. In addition, the double Δ Momca1mca2 mutant strain showed increased radial growth in the presence of oxidative stress. Interestingly, the Δ Momca1mca2 strain showed an increase accumulation of insoluble aggregates compared to the wild-type strain during vegetative growth. Our findings suggest that MoMca1 and MoMca2 promote the clearance of insoluble aggregates in M. oryzae , demonstrating the important role these metacaspases have in fungal protein homeostasis. Furthermore, these metacaspase proteins may play additional roles, like in regulating stress responses, that would help maintain the fitness of fungal cells required for host infection. IMPORTANCE Magnaporthe oryzae causes rice blast disease that threatens global food security by resulting in the severe loss of rice production every year. A tightly regulated life cycle allows M. oryzae to disarm the host plant immune system during its biotrophic stage before triggering plant cell death in its necrotrophic stage. The ways M. oryzae navigates its complex life cycle remains unclear. This work characterizes two metacaspase proteins with peptidase activity in M. oryzae that are shown to be involved in the regulation of fungal growth and development prior to infection by potentially helping maintain fungal fitness. This study provides new insight into the role of metacaspase proteins in filamentous fungi by illustrating the delays in M. oryzae morphogenesis in the absence of these proteins. Understanding the mechanisms by which M. oryzae morphology and development promote its devastating pathogenicity may lead to the emergence of proper methods for disease control.

The hemibiotrophic fungus Magnaporthe oryzae produces invasive hyphae enclosed in a plant-derived interfacial membrane, known as the extra-invasive hyphal membrane (EIHM), in living rice cells. Little is known about when the EIHM is disrupted and how the disruption contributes to blast disease. Here we show that EIHM disruption correlates with the hyphal growth stage in first-invaded susceptible rice cells. Our approach utilized GFP secreted from invasive hyphae as an EIHM integrity reporter. Secreted-GFP accumulated in the EIHM compartment but appeared in the rice cytoplasm when the EIHM integrity was compromised. Live-cell imaging of secreted-GFP and various fluorescent reporters revealed that EIHM disruption led to rice vacuole rupture and cell death limited to the invaded cell with closed plasmodesmata. We report that EIHM disruption and host cell death are landmarks delineating three distinct infection phases (early biotrophic, late biotrophic, and transient necrotrophic phases) within the first-invaded cell before reestablishment of biotrophy in second-invaded cells. M. oryzae effectors exhibited phase-specific localizations, including entry of the apoplastic effector Bas4 into the rice cytoplasm during the late biotrophic phase. Understanding how the phase-specific dynamics are regulated and linked to host susceptibility will offer potential targets that can be exploited to control blast disease.

Onion ( Allium. cepa L ), garlic ( A. sativum L.), and other members of the Allium genus produce volatile antimicrobial thiosulfinates upon cellular damage. Allicin has been known since the 1950s as the primary antimicrobial thiosulfinate compound and odorant produced by garlic. However, the roles of endogenous thiosulfinate production in host-bacterial pathogen interactions have not been described. The bacterial onion pathogen Pantoea ananatis , which lacks both the virulence Type III and Type II Secretion Systems, induces necrotic symptoms and extensive cell death in onion tissues dependent on a proposed secondary metabolite synthesis chromosomal gene cluster. We found strong correlation between the genetic requirements for P. ananatis to colonize necrotized onion tissue and its capacity for tolerance to the thiosulfinate allicin based on the presence of an eleven gene, plasmid-borne, virulence cluster of sulfur/redox genes. We have designated them " alt " genes for allicin tolerance. We show that allicin and onion thiosulfinates restrict bacterial growth with similar kinetics. The alt gene cluster is sufficient to confer allicin tolerance and protects the glutathione pool during allicin treatment. Independent alt genes make partial phenotypic contributions indicating that they function as a collective cohort to manage thiol stress. Our work implicates endogenous onion thiosulfinates produced during cellular damage as mediators of interactions with bacteria. The P. ananatis -onion pathosystem can be modeled as a chemical arms race of pathogen attack, host chemical counter-attack, and pathogen resistance.

To investigate the mitotic dynamics of an appressorium, we used time-lapse confocal imaging of a fluorescence-based mitotic reporter strain of Magnaporthe oryzae. We present evidence that: (i) appressoria remain viable and mitotically active after host penetration, (ii) appressorial mitosis, like invasive hyphal mitosis, is semi-closed, (iii) sister chromatids separate within the appressorium, (iv) a mitotic appressorial nucleus undergoes extreme constriction and elongation as it migrates through the penetration peg in a manner analogous to mitosis during cell-to-cell movement of invasive hyphae. These results provide new insight into the potential roles of the appressorium after host penetration and highlight the unique mitotic dynamics during rice blast infection.

Abstract Background To cause an economically important blast disease on rice, the filamentous fungus Magnaporthe oryzae forms a specialized infection structure, called an appressorium, to penetrate host cells. Once inside host cells, the fungus produces a filamentous primary hypha that differentiates into multicellular bulbous invasive hyphae (IH), which are surrounded by a host-derived membrane. These hyphae secrete cytoplasmic effectors that enter host cells presumably via the biotrophic interfacial complex (BIC). The first IH cell, also known as the side BIC-associated cell, is a specialized effector-secreting cell essential for a successful infection. This study aims to determine cellular processes that lead to the development of this effector-secreting first IH cell inside susceptible rice cells. Results Using live-cell confocal imaging, we determined a series of cellular events by which the appressorium gives rise to the first IH cell in live rice cells. The filamentous primary hypha extended from the appressorium and underwent asymmetric swelling at its apex. The single nucleus in the appressorium divided, and then one nucleus migrated into the swollen apex. Septation occurred in the filamentous region of the primary hypha, establishing the first IH cell. The tip BIC that was initially associated with the primary hypha becomes the side BIC on the swollen apex prior to nuclear division in the appressorium. The average distance between the early side BIC and the nearest nucleus in the appressorium was estimated to be more than 32 µm. These results suggest an unknown mechanism by which effectors that are expressed in the appressorium are transported through the primary hypha for their secretion to the distantly located BIC. When M. oryzae was inoculated on heat-killed rice cells, penetration proceeded as normal, but there was no differentiation of a bulbous IH cell, suggesting its specialization for establishment of biotrophic infection. Conclusions Our studies reveal cellular dynamics associated with the development of the effector-secreting first IH cell. Our data raise new mechanistic questions concerning hyphal differentiation in response to host environmental cues and effector trafficking from the appressorium to the BIC.