Abstract Plasmodium species, the causative agent of malaria, have a complex life cycle involving two hosts. The sporozoite life stage is characterized by an extended phase in the mosquito salivary glands followed by free movement and rapid invasion of hepatocytes in the human host. This transmission stage has been the subject of many transcriptomics and proteomics studies and is also targeted by the most advanced malaria vaccine. We applied Bayesian data integration to determine which proteins are not only present in sporozoites but are also specific to that stage. Transcriptomic and proteomic Plasmodium data sets from 26 studies were weighted for how representative they are for sporozoites, based on a carefully assembled gold standard for Plasmodium falciparum (Pf) proteins known to be present or absent during the sporozoite life stage. Of 5418 Pf genes for which expression data were available at the RNA level or at the protein level, 1105 were identified as enriched in sporozoites and 90 specific to them. We show that Pf sporozoites are enriched for proteins involved in type II fatty acid synthesis in the apicoplast and GPI anchor synthesis, but otherwise appear metabolically relatively inactive, in the salivary glands of mosquitos. Newly annotated hypothetical sporozoite-specific and sporozoite-enriched proteins highlight sporozoite specific functions. They include PF3D7_0104100 that we identified to be homologous to the prominin family, which in human has been related to a quiescent state of cancer cells. We document high levels of genetic variability for sporozoite proteins, specifically for sporozoite-specific proteins that elicit antibodies in the human host. Nevertheless, we can identify nine relatively well-conserved sporozoite proteins that elicit antibodies and that together can serve as markers for previous exposure. Our understanding of sporozoite biology benefits from identifying key pathways that are enriched during this life stage. This work can guide studies of molecular mechanisms underlying sporozoite biology and potential well-conserved targets for marker and drug development. Author Summary When a person is bitten by an infectious malaria mosquito, sporozoites are injected into the skin with mosquito saliva. These sporozoites then travel to the liver, invade hepatocytes and multiply before the onset of the symptom-causing blood stage of malaria. By integrating published data, we contrast sporozoite protein expression with other life stages to filter out the unique features of sporozoites that help us understand this stage. We used a “guideline” that we derived from the literature on individual proteins so that we knew which proteins should be present or absent at the sporozoite stage, allowing us to weigh 26 data sets for their relevance to sporozoites. Among the newly discovered sporozoite-specific genes are candidates for fatty acid synthesis while others might play a role keeping the sporozoites in an inactive state in the mosquito salivary glands. Furthermore, we show that most sporozoite-specific proteins are genetically more variable than non-sporozoite proteins. We identify a set of conserved sporozoite proteins against which antibodies can serve as markers of recent exposure to sporozoites or that can serve as vaccine candidates. Our predictions of sporozoite-specific proteins and the assignment of previously unknown functions give new insights into the biology of this life stage.

Abstract Plasmodium species have a single mitochondrion that is essential for their survival and has been successfully targeted by anti-malarial drugs. Most mitochondrial proteins are imported into this organelle and our picture of the Plasmodium mitochondrial proteome remains incomplete. Many data sources contain information about mitochondrial localization, including proteome and gene expression profiles, orthology to mitochondrial proteins from other species, co-evolutionary relationships, and amino acid sequences, each with different coverage and reliability. To obtain a comprehensive, prioritized list of Plasmodium falciparum mitochondrial proteins, we rigorously analyzed and integrated eight datasets using Bayesian statistics into a predictive score per protein for mitochondrial localization. At a corrected false discovery rate of 25%, we identified 445 proteins with a sensitivity of 87% and a specificity of 97%. They include proteins that have not been identified as mitochondrial in other eukaryotes but have characterized homologs in bacteria that are involved in metabolism or translation. Mitochondrial localization of seven Plasmodium berghei orthologs was confirmed by epitope labeling and co-localization with a mitochondrial marker protein. One of these belongs to a newly identified apicomplexan mitochondrial protein family that in P. falciparum has four members. With the experimentally validated mitochondrial proteins and the complete ranked P. falciparum proteome, which we have named PlasmoMitoCarta, we present a resource to study unique proteins of Plasmodium mitochondria.

Anopheles stephensi, an efficient Asian malaria vector, recently spread into the Horn of Africa and may increase malaria receptivity in African urban areas. We assessed occurrence, genetic complexity, blood meal source and infection status of An. stephensi in Awash Sebat Kilo town, Ethiopia. We used membrane feeding assays to assess competence of local An. stephensi to P. vivax and P. falciparum isolates from clinical patients. 75.3% of the examined waterbodies were infested with An. stephensi developmental stages that were genetically closely related to isolates from Djibouti and Pakistan. Both P. vivax and P. falciparum were detected in wild-caught adult An. stephensi. Local An. stephensi was more receptive to P. vivax compared to a colony of An. arabiensis. We conclude that An. stephensi is an established vector in this part of Ethiopia, highly permissive for local P. vivax and P. falciparum isolates and presents an important new challenge for malaria control.

Transmission of Plasmodium falciparum depends on the presence of mature gametocytes that can be ingested by mosquitoes taking a bloodmeal when feeding on human skin. It has long been hypothesised that skin sequestration contributes to efficient transmission. Although skin sequestration would have major implications for our understanding of transmission biology and the suitability of mosquito feeding methodologies to measure the human infectious reservoir, it has never been formally tested. In two populations of naturally infected gametocyte carriers from Burkina Faso, we assessed transmission potential to mosquitoes and directly quantified male and female gametocytes and asexual parasites in: i) finger prick blood, ii) venous blood, iii) skin biopsies, and in pools of mosquitoes that fed iv) on venous blood or, v) directly on the skin. Whilst more mosquitoes became infected when feeding directly on the skin compared to venous blood, concentrations of gametocytes in the subdermal skin vasculature were identical to that in other blood compartments. Asexual parasite densities, gametocyte densities and sex ratios were identical in the mosquito blood meals taken directly from the skin of parasite carriers and their venous blood. We also observed sparse gametocytes in skin biopsies from legs and arms of gametocyte carriers by microscopy. Taken together, we provide conclusive evidence for the absence of significant skin sequestration of P. falciparum gametocytes. Gametocyte densities in peripheral blood are thus informative for predicting onward transmission potential to mosquitoes. Quantifying this human malaria transmission potential is of pivotal importance for the deployment and monitoring of malaria elimination initiatives.

Plasmodium gametocytes are the sexual forms of the malaria parasite essential for transmission to mosquitoes. To better understand how gametocytes differ from asexual blood-stage parasites, we performed a systematic analysis of available omics data for P. falciparum and other Plasmodium species. 18 transcriptomic and proteomic data sets were evaluated for the presence of curated gold standards of 41 gametocyte-specific versus 46 non-gametocyte genes and integrated using Bayesian probabilities, resulting in gametocyte-specificity scores for all P. falciparum genes. To illustrate the utility of the gametocyte score, we explored newly predicted gametocyte-specific genes as potential biomarkers of gametocyte carriage and exposure. We analyzed the humoral immune response in field samples against 30 novel gametocyte-specific antigens and found five antigens to be differentially recognized by gametocyte carriers as compared to malaria-infected individuals without detectable gametocytes. We also validated the gametocyte-specificity of 15 identified gametocyte transcripts on culture material and samples from naturally infected individuals, resulting in eight transcripts that were >1000-fold higher expressed in gametocytes compared to asexual parasites and whose transcript abundance allowed gametocyte detection in naturally infected individuals. Our integrated genome-wide gametocyte-specificity scores provide a comprehensive resource to identify targets and monitor P. falciparum gametocytemia.