Summary

 Oct4, Sox2, Klf4, and cMyc (OSKM) reprogram somatic cells to pluripotency. To gain a mechanistic understanding of their function, we mapped OSKM-binding, stage-specific transcription factors (TFs), and chromatin states in discrete reprogramming stages and performed loss- and gain-of-function experiments. We found that OSK predominantly bind active somatic enhancers early in reprogramming and immediately initiate their inactivation genome-wide by inducing the redistribution of somatic TFs away from somatic enhancers to sites elsewhere engaged by OSK, recruiting Hdac1, and repressing the somatic TF Fra1. Pluripotency enhancer selection is a stepwise process that also begins early in reprogramming through collaborative binding of OSK at sites with high OSK-motif density. Most pluripotency enhancers are selected later in the process and require OS and other pluripotency TFs. Somatic and pluripotency TFs modulate reprogramming efficiency when overexpressed by altering OSK targeting, somatic-enhancer inactivation, and pluripotency enhancer selection. Together, our data indicate that collaborative interactions among OSK and with stage-specific TFs direct both somatic-enhancer inactivation and pluripotency-enhancer selection to drive reprogramming.

Abstract Genome-wide association studies (GWAS) have linked thousands of genetic variants to various complex traits or diseases. However, most identified variants have weak individual effects, are correlated with nearby polymorphisms due to linkage disequilibrium (LD), and are located in non-coding cis-regulatory elements (CREs). These characteristics complicate the assessment of the direct impact of each variant on tissue specific gene expression and phenotype. To address this challenge, we have developed a novel algorithm that leverages polymer folding and 3D chromatin interactions to prioritize and identify putative causal variants and their target genes. From the millions of eQTL-Gene pairs identified by GTEx in human somatic tissues, we classify only ∼10-20% as putative functional eQTL-Gene pairs supported by phenotypic associations confirmed through CRISPR deletion experiments. Our findings show that unlike most variants, functional eQTL-Gene pairs predominantly reside within the same topologically associating domain (TAD) and have strong associations with cell-type specific cis-regulatory elements (CREs), enriched for binding sites of tissue-specific transcription factors. Unlike most approaches that rely on linear distance or other chromatin features (histone code, accessibility), our algorithm emphasizes the importance of physical interactions and 3D chromatin folding in gene regulation, as the identified eQTL-Gene pairs are all among the small fraction of physical chromatin interactions sufficient for chromatin locus folding. Overall, our algorithm reduces false positive associations between DNA variants and genes identified by eQTL analysis and uncovers novel variant-gene pair associations. These findings suggest a mechanism where a small number of regulatory variants control tissue specific gene expression via their physical association with target genes confined within the same TAD. Our approach provides new insights into the molecular mechanisms driving GWAS phenotypes.

Nuclear compartments play diverse roles in regulating gene expression, yet the molecular forces and components driving compartment formation are not well understood. Studying how the lncRNA Xist establishes the inactive-X-chromosome (Xi)-compartment, we found that the Xist RNA-binding-proteins PTBP1, MATR3, TDP43, and CELF1 form a condensate to create an Xi-domain that can be sustained in the absence of Xist . The E-repeat-sequence of Xist serves a multivalent binding-platform for these proteins. Without the E-repeat, Xist initially coats the X-chromosome during XCI onset but subsequently disperses across the nucleus with loss of gene silencing. Recruitment of PTBP1, MATR3, TDP-43 or CELF1 to ΔE- Xist rescues these phenotypes, and requires both self-association of MATR3 and TDP-43 and a heterotypic PTBP1-MATR3-interaction. Together, our data reveal that Xist sequesters itself within the Xi-territory and perpetuates gene silencing by seeding a protein-condensate. Our findings uncover an unanticipated mechanism for epigenetic memory and elucidate the interplay between RNA and RNA-binding-proteins in creating compartments for gene regulation.

Whole-genome bisulfite sequencing (WGBS) and reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) are widely used for measuring DNA methylation levels on a genome-wide scale(1). Both methods have limitations: WGBS is expensive and prohibitive for most large-scale projects; RRBS only interrogates 6-12% of the CpGs in the human genome(16,19). Here, we introduce methylation- sensitive restriction enzyme bisulfite sequencing (MREBS) which has the reduced sequencing requirements of RRBS, but significantly expands the coverage of CpG sites in the genome. We built a multiple regression model that combines the two features of MREBS: the bisulfite conversion ratios of single cytosines (as in WGBS and RRBS) as well as the number of reads that cover each locus (as in MRE-seq(12)). This combined approach allowed us to estimate differential methylation across 60% of the genome using read count data alone, and where counts were sufficiently high in both samples (about 1.5% of the genome), our estimates were significantly improved by the single CpG conversion information. We show that differential DNA methylation values based on MREBS data correlate well with those based on WGBS and RRBS. This newly developed technique combines the sequencing cost of RRBS and DNA methylation estimates on a portion of the genome similar to WGBS, making it ideal for large-scale projects of mammalian genomes.

Both human and mouse fibroblasts can be reprogrammed to pluripotency with Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (OSKM) transcription factors. While both systems generate pluripotency, human reprogramming takes considerably longer than mouse. To assess additional similarities and differences, we sought to compare the binding of the reprogramming factors between the two systems. In human fibroblasts, the OSK factors initially target many more closed chromatin sites compared to mouse. Despite this difference, the intra- and intergenic distribution of target sites, target genes, primary binding motifs, and combinatorial binding patterns between the reprogramming factors are largely shared. However, while many OSKM binding events in early mouse cell reprogramming occur in syntenic regions, only a limited number is conserved in human. In summary, these findings suggest similar general effects of OSKM binding across these two species, even though the detailed regulatory networks have diverged significantly.