Complement receptor 3 (CR3, also known as Mac-1, integrin M2, or CD11b/CD18) is expressed on a subset of myeloid and certain activated lymphoid cells. CR3 is essential for the phagocytosis of complement-opsonized particles such as pathogens and apoptotic or necrotic cells. The receptor recognizes cells opsonized with the complement fragment iC3b and to a lesser extend C3dg. While the interaction between the iC3b thioester domain and the ligand binding CR3 M I-domain is now structurally well characterized, additional CR3-iC3b interactions lack structural insight. Using an integrated structural biology approach, we analyze the interaction between iC3b and the headpiece fragment of the CR3 ectodomain. Surface plasmon resonance experiments found an affinity of 30 nM of CR3 for iC3b compared to 515 nM for the iC3b thioester domain. The iC3b1 intermediate formed during factor I degradation is shown to be a CR3 headpiece ligand in addition to iC3b and C3dg. Small angle x-ray scattering analysis reveals that in solution the iC3b-CR3 complex is more compact than either of the individual proteins and prior models of the complex derived by electron microscopy. Overall, the data suggest that the iC3b-CR3 complex is structurally ordered and governed by high affinity. The identification of significant CR3-iC3b interactions outside the iC3b TE domain appears as a promising target for future therapeutics interfering specifically with the formation of the CR3-iC3b complex.### Competing Interest Statement

Abstract Fibrinogen is a soluble, multi-subunit and multi-domain dimeric protein, which, upon its proteolytic cleavage by thrombin, is converted to insoluble fibrin initiating polymerization that substantially contributes to clot growth. The consentaneous structural view of the soluble form of fibrinogen is relatively straight and rigid-like. However, fibrinogen contains numerous, transiently-accessible “cryptic” epitopes for hemostatic and immunologic proteins, suggesting that fibrinogen exhibits conformational flexibility, which may play functional roles in its temporal and spatial interactions. Hitherto, there has been limited information on the solution structure and internal flexibility of soluble fibrinogen. Here, utilizing an integrative, biophysical approach involving temperature-dependent hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry, small angle X-ray scattering, and negative stain electron microscopy, we present a holistic, conformationally dynamic model of human fibrinogen in solution. Our data reveal a high degree of internal flexibility, accommodated by four major and distinct flexible sites along the central axis of the protein. We propose that the fibrinogen structure in solution consists of a complex, conformational landscape with multiple local minima, rather than a single, rigid topology. This is further supported by the location of numerous point mutations that are linked to dysfibrinogenemia, and post-translational modifications, residing near fibrinogen flexions. This work provides a molecular basis for the structural “dynamism” of fibrinogen that is expected to influence the broad swath of functionally diverse macromolecular interactions and fine-tune the structural and mechanical properties of blood clots.

Abstract Integrin αIIbβ3 is the key receptor regulating platelet retraction and accumulation, thus pivotal for hemostasis, and arterial thrombosis as well as a proven drug-target for antithrombotic therapies. Here we resolve the cryoEM structures of the intact full-length αIIbβ3, which covers three distinct states along the activation pathway. Here, we resolve intact αIIbβ3 structure at 3Å resolution, revealing the overall topology of the heterodimer with the transmembrane (TM) helices and the head region ligand-binding domain tucked in a specific angle proximity to the TM region. In response to the addition of a Mn 2+ agonist, we resolved two coexisting states, “intermediate” and “pre-active”. Our structures show conformational changes of the intact αIIbβ3 activating trajectory, as well as a unique twisting of the lower integrin legs representing an intermediate state (TM region at a twisting conformation) and a coexisting pre-active state (bent and opening in leg), which is required for inducing the transitioning platelets to accumulate. Our structure provides for the first time direct structural evidence for the lower legs’ involvement in full-length integrin activation mechanisms. Additionally, our structure offers a new strategy to target the αIIbβ3 lower leg allosterically instead of modulating the affinity of the αIIbβ3 head region.

Normally, von Willebrand factor (VWF) remains inactive unless its A1A2 domains undergo a shear stress-triggered conformational change. We demonstrated the capacity of a recombinant A2 domain of VWF to bind and to affect fibrin formation, altering the fibrin clot structure. The data indicated that VWF contains an additional binding site for fibrin in the A2 domain that plays a role in the incorporation of VWF to the polymerizing fibrin. This study is to examine the hypothesis that active plasma VWF directly influence fibrin polymerization and the structure of fibrin clots. The study used healthy and type 3 von Willebrand disease (VWD) plasma, purified plasma VWF, fibrin polymerization assays, confocal microscopy and scanning electron microscopy. The exposed A2 domain in active VWF harbors additional binding sites for fibrinogen, and significantly potentiates fibrin formation ( P < 0.02). Antibody against the A2 domain of VWF significantly decreased the initial rate of change of fibrin formation ( P < 0.002). Clot analyses revealed a significant difference in porosity between normal and type 3 VWD plasma ( P < 0.008), further supported by scanning electron microscopy, which demonstrated thicker fibrin fibers in the presence of plasma VWF ( P < 0.0003). Confocal immunofluorescence microscopy showed punctate VWF staining along fibrin fibrils, providing visual evidence of the integration of plasma VWF into the fibrin matrix. The study with type 3 VWD plasma supports the hypothesis that plasma VWF directly influences fibrin polymerization and clot structure. In addition, a conformational change in the A1A2 domains exposes a hidden fibrin(ogen) binding site, indicating that plasma VWF determines the fibrin clot structure.