All animals coordinate growth and maturation to reach their final size and shape. In insects, insulin family molecules control growth and metabolism, whereas pulses of the steroid 20-hydroxyecdysone (20E) initiate major developmental transitions. We show that 20E signaling also negatively controls animal growth rates by impeding general insulin signaling involving localization of the transcription factor dFOXO and transcription of the translation inhibitor 4E-BP . We also demonstrate that the larval fat body, equivalent to the vertebrate liver, is a key relay element for ecdysone-dependent growth inhibition. Hence, ecdysone counteracts the growth-promoting action of insulins, thus forming a humoral regulatory loop that determines organismal size.

Most organisms have evolved defense mechanisms to protect themselves from viruses and other pathogens. Arthropods lack the protein-based adaptive immune response found in vertebrates. Here we show that the central catalytic component of the RNA-induced silencing complex (RISC), the nuclease Argonaute 2 (Ago-2), is essential for antiviral defense in adult Drosophila melanogaster. Ago-2-defective flies are hypersensitive to infection with a major fruit fly pathogen, Drosophila C virus (DCV), and with Cricket Paralysis virus (CrPV). Increased mortality in ago-2 mutant flies was associated with a dramatic increase in viral RNA accumulation and virus titers. The physiological significance of this antiviral mechanism is underscored by our finding that DCV encodes a potent suppressor of RNA interference (RNAi). This suppressor binds long double-stranded RNA (dsRNA) and inhibits Dicer-2-mediated processing of dsRNA into short interfering RNA (siRNA), but does not bind short siRNAs or disrupt the microRNA (miRNA) pathway. Based on these results we propose that RNAi is a major antiviral immune defense mechanism in Drosophila .

Abstract Cells remodel their cytoplasm with force-generating cytoskeletal motors 1 . Their activity generates random forces that stir the cytoplasm, agitating and displacing membrane-bound organelles like the nucleus in somatic 2–4 and germ 5–7 cells. These forces are transmitted inside the nucleus 4,7 , yet their consequences on liquid-like biomolecular condensates 8–10 residing in the nucleus remain unexplored. Here, we probe experimentally and computationally diverse nuclear condensates, that include nuclear speckles, Cajal bodies, and nucleoli, during cytoplasmic remodeling of female germ cells named oocytes. We discover that growing mammalian oocytes deploy cytoplasmic forces to timely impose multiscale reorganization of nuclear condensates for the success of meiotic divisions. These cytoplasmic forces accelerate nuclear condensate collision-coalescence and molecular kinetics within condensates. Inversely, disrupting the forces decelerates nuclear condensate reorganization on both scales, compromising condensate-associated mRNA processing and consequently hindering oocyte divisions that drive female fertility. We establish that cytoplasmic forces can reorganize nuclear condensates in an evolutionary conserved fashion in insects. Our work implies that cells evolved a mechanism, based on cytoplasmic force tuning, to functionally regulate a broad range of nuclear condensates across scales. This finding opens new perspectives when studying condensate-associated pathologies like cancer, neurodegeneration and viral infections 11–13 .

Abstract Background The vast ecosystem of single-cell RNA-seq tools has until recently been plagued by an excess of diverging analysis strategies, inconsistent file formats, and compatibility issues between different software suites. The uptake of 10x Genomics datasets has begun to calm this diversity, and the bioinformatics community leans once more towards the large computing requirements and the statistically-driven methods needed to process and understand these ever-growing datasets. Results Here we outline several Galaxy workflows and learning resources for scRNA-seq, with the aim of providing a comprehensive analysis environment paired with a thorough user learning experience that bridges the knowledge gap between the computational methods and the underlying cell biology. The Galaxy reproducible bioinformatics framework provides tools, workflows and trainings that not only enable users to perform one-click 10x preprocessing, but also empowers them to demultiplex raw sequencing from custom tagged and full-length sequencing protocols. The downstream analysis supports a wide range of high-quality interoperable suites separated into common stages of analysis: inspection, filtering, normalization, confounder removal and clustering. The teaching resources cover an assortment of different concepts from computer science to cell biology. Access to all resources is provided at the singlecell.usegalaxy.eu portal. Conclusions The reproducible and training-oriented Galaxy framework provides a sustainable HPC environment for users to run flexible analyses on both 10x and alternative platforms. The tutorials from the Galaxy Training Network along with the frequent training workshops hosted by the Galaxy Community provide a means for users to learn, publish and teach scRNA-seq analysis. Key Points Single-cell RNA-seq has stabilised towards 10x Genomics datasets. Galaxy provides rich and reproducible scRNA-seq workflows with a wide range of robust tools. The Galaxy Training Network provides tutorials for the processing of both 10x and non-10x datasets.

Abstract Ageing is characterised at the molecular level by six transcriptional ‘hallmarks of ageing’, that are commonly described as progressively affected as time passes. By contrast, the ‘Smurf’ assay separates high-and-constant-mortality risk individuals from healthy, zero-mortality risk individuals, based on increased intestinal permeability. Performing whole body total RNA sequencing, we found that Smurfness distinguishes transcriptional changes associated with chronological age from those associated with biological age. We show that transcriptional heterogeneity increases with chronological age in non-Smurf individuals preceding the other five hallmarks of ageing, that are specifically associated with the Smurf state. Using this approach, we also devise targeted pro-longevity genetic interventions delaying entry in the Smurf state. We anticipate that increased attention to the evolutionary conserved Smurf phenotype will bring about significant advances in our understanding of the mechanisms of ageing. Graphical abstract The two-phase model of ageing allows to study separately the effect of chronological and physiological age. (A) Classic approaches for studying ageing tend to consider it as a black box affecting all individuals progressively from birth to death. Instead, the Smurf phenotype shows that life can be divided into two consecutive phases separated by an abrupt transition. (B) All individuals undergo this transition at a different moment in their life, prior to death. This allows us to switch from population based approaches, comparing bulks of age-matched individuals through time, to individuals-centred approaches relying on direct access to their transition status. (C) Such paradigm shift shows that hallmarks of ageing long thought to progressively change with age are actually mostly affected in a growing proportion of Smurfs, allowing for the identification of the chain of events accompanying ageing and death from natural causes. (D) By studying the behaviour of the ageing transcriptome as a function of chronological age and Smurfness separately, we demonstrate that the progressively changing transcriptional ageing signature, as described in Frenk & Houseley (2018), is in fact the convolution changes accompanying chronological age signature (increased transcriptional noise) and changes associated with Smurfness (or biological age) signature (increased stress response and inflammation, decreased expression of ribosomal and mitochondrial genes). We also identified a hallmark partially associated with only old Smurfs (ATH5), suggesting that chronological age can affect, late in life, the Smurf response.

Abstract Glioblastoma (GBM) is the most common primary malignant brain tumor in adults, yet it remains refractory to systemic therapy. Elimination of senescent cells has emerged as a promising new treatment approach against cancer. Here, we investigated the contribution of senescent cells to GBM progression. Senescent cells were identified in patient and mouse GBMs. Partial removal of p16 Ink4a -expressing malignant senescent cells, which make up less than 7 % of the tumor, modified the tumor ecosystem and improved the survival of GBM-bearing mice. By combining single cell and bulk RNA sequencing, immunohistochemistry and genetic knockdowns, we identified the NRF2 transcription factor as a determinant of the senescent phenotype. Remarkably, our mouse senescent transcriptional signature and underlying mechanisms of senescence are conserved in patient GBMs, in whom higher senescence scores correlate with shorter survival times. These findings suggest that senolytic drug therapy may be a beneficial adjuvant therapy for patients with GBM.

piRNA-mediated repression of transposable elements (TE) in the germline limits the accumulation of heritable mutations caused by their transposition in the genome. It is not clear whether the piRNA pathway plays a functional role in adult, non-gonadal tissues in Drosophila melanogaster. To address this question, we first analyzed the small RNA content of adult Drosophila melanogaster heads. We found that varying amount of piRNA-sized, ping-pong positive molecules in heads correlates with contamination by gonadal tissue during RNA extraction, suggesting that most of piRNAs detected in head sequencing libraries originate from gonads. We next sequenced the heads of wild type and piwi mutants to address whether piwi loss of function would affect the low amount of piRNA-sized, ping-pong negative molecules that are still detected in heads hand-checked to avoid gonadal contamination. We find that loss of piwi does not affect significantly these 24-28 RNA molecules. Instead, we observe increased siRNA levels against the majority of Drosophila transposable element families. To determine the effect of this siRNA level change on transposon expression, we sequenced the transcriptome of wild type, piwi, dicer-2 and piwi, dicer-2 double-mutant fly heads. We find that RNA expression levels of the majority of TE families in piwi or dicer-2 mutants remain unchanged and that TE transcript abundance increases significantly only in piwi, dicer-2 double-mutants. These results lead us to suggest a dual-layer model for TE repression in adult somatic tissues. Piwi-mediated transcriptional gene silencing (TGS) established during embryogenesis constitutes the first layer of TE repression whereas Dicer-2-dependent siRNA-mediated post-transcriptional gene silencing (PTGS) provide a backup mechanism to repress TEs that escape silencing by piwi-mediated TGS.

2’-O-methylation (Nm) represents one of the most common RNA modifications. Nm affects RNA structure and function with crucial roles in various RNA-mediated processes ranging from RNA silencing, translation, self versus non-self recognition to viral defense mechanisms. Here, we identify two novel Nm methyltransferases (Nm-MTases) in Drosophila melanogaster (CG7009 and CG5220) as functional orthologs of yeast TRM7 and human FTSJ1, respectively. Genetic knockout studies together with MALDI-TOF mass spectrometry and RiboMethSeq mapping revealed that CG7009 is responsible for methylating the wobble position in tRNAPhe, tRNATrp and tRNALeu, while subsequently, CG5220 methylates position C32 in the same tRNAs and targets also additional tRNAs. CG7009 or CG5220 mutant animals were viable and fertile but exhibited various phenotypes such as life span reduction, small RNA pathways dysfunction and increased sensitivity to RNA virus infections. Our results provide the first detailed characterization of two TRM7 family members in Drosophila and uncover a molecular link between enzymes catalysing Nm at specific tRNAs and small RNA-induced gene silencing pathways.

Abstract T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is a hematopoietic malignancy characterized by an increased proliferation and incomplete maturation of T-cell progenitors. Despite therapeutic improvements, relapses are often of bad prognosis. Therapeutic vulnerabilities and chemoresistance mechanisms arising from cell plasticity induced by the bone marrow (BM) microenvironment remain an important field of investigation. Employing single cell RNA sequencing (scRNAseq) of human T-ALL cells recovered from adipocyte-rich and -poor BM, a distinct leukemic stem cell (LSC) population defined by quiescence and elevated CD44 level (Ki67 neg/low CD44 high ) expression is identified in both territories. In vivo chemotherapy demonstrated that the LSC population evades drug treatment. Patient sample analyses confirmed the presence of Ki67 neg/low CD44 high LSC both at diagnosis and relapse that displayed a specific transcriptomic signature. Interestingly, the intense expression of CD44 in T-ALL Ki67 neg/low LSC was associated with E-selectin binding. Importantly, when 39 human T-ALL samples were analyzed, the E-selectin binding ability was found significantly higher in Relapse/Refractory compared to drug-sensitive patients. These findings characterize a T-ALL LSC population with chemoresistant properties and shade light on new strategies for prognostic stratification while opening avenues for novel therapeutic options.

Glioblastoma cell ability to adapt their functioning to microenvironment changes is a source of the extensive intra-tumor heterogeneity characteristic of this devastating malignant brain tumor. A systemic view of the metabolic pathways underlying glioblastoma cell functioning states is lacking. We analyzed public single cell RNA-sequencing data from glioblastoma surgical resections, which offer the closest available view of tumor cell heterogeneity as encountered at the time of patients' diagnosis. Unsupervised analyses revealed that information dispersed throughout the cell transcript repertoires encoded the identity of each tumor and masked information related to cell functioning states. Data reduction based on an experimentally-defined signature of transcription factors overcame this hurdle. It allowed cell grouping according to their tumorigenic potential, regardless of their tumor of origin. The approach relevance was validated using an independent dataset of glioblastoma tissue transcriptomes, patient-derived cell lines and orthotopic xenografts. Overexpression of genes coding for amino acid and lipid metabolism enzymes involved in antioxidative, energetic and cell membrane processes characterized cells with high tumorigenic potential. Modeling of their expression network highlighted the very long chain polyunsaturated fatty acid synthesis pathway at the core of the network. Expression of its most downstream enzymatic component, ELOVL2, was associated with worsened patient survival, and required for cell tumorigenic properties in vivo. Our results demonstrate the power of signature-driven analyses of single cell transcriptomes to obtain an integrated view of metabolic pathways at play within the heterogeneous cell landscape of patient tumors.