Chimeric antigen receptor (CAR)-T cells represent a major breakthrough in cancer therapy, wherein a patient's own T cells are engineered to recognize a tumor antigen, resulting in activation of a local cytotoxic immune response. However, CAR-T cell therapies are currently limited to the treatment of B cell cancers and their effectiveness is hindered by resistance from antigen-negative tumor cells, immunosuppression in the tumor microenvironment, eventual exhaustion of T cell immunologic functions and frequent severe toxicities. To overcome these problems, we have developed a novel class of CAR-T cells engineered to express an enzyme that activates a systemically administered small-molecule prodrug in situ at a tumor site. We show that these synthetic enzyme-armed killer (SEAKER) cells exhibit enhanced anticancer activity with small-molecule prodrugs, both in vitro and in vivo in mouse tumor models. This modular platform enables combined targeting of cellular and small-molecule therapies to treat cancers and potentially a variety of other diseases.

Purpose Cyclin dependent kinase 4/6 inhibitors (CDK4/6i) lead to cell-cycle arrest but also demonstrate antineoplastic activity through triggering T cell-mediated immunity. One of the potential mechanisms responsible for this immunological effect might be qualitative and quantitative changes in human leukocyte antigen (HLA) ligands on the cell surface after treatment with CDK4/6i. These changes may increase the immunogenicity of breast cancer cells offering potential synergies for combinations with cancer immunotherapies. Experimental Design We investigated the ability of two CDK4/6 inhibitors (CDK4/6i), Abemaciclib and Palbociclib, to alter the immunopeptidome at subclinical, non-toxic, levels in different breast cancer cell lines. Biochemical isolation of HLA ligands, identification by mass spectrometry and subsequent network analysis after drug treatment were used to characterize the changes in the immunopeptidome. The mechanisms for altered CDK4/6 presentation were explored. Results Low-dose treatment with 100nM of Abemaciclib and Palbociclib led to upregulation of cell surface HLA levels and induced hundreds of HLA ligands in breast cancer cell lines. These new ligands were significantly and most strongly enriched for peptides derived from proteins involved in the “G1/S phase transition of cell cycle” pathway and included among others, HLA ligands from CDK4, CDK6, Cyclin D1 and Cyclin E1. An increase in transcript, protein, and subsequent ubiquitination for Cyclin D1, which could lead to enhanced degradation of the target protein, was identified as a potential mechanism for the altered presentation of peptides. Conclusions CDK4/6i treatment gave rise to drug-induced antigens through cell cycle disruption and increased antigen presentation. Interestingly, these induced HLA ligands are often sourced from the proteins of the CDK4/CDK6/CCND1 complex or more downstream interaction partners, providing evidence that inhibition of a distinct cellular pathway leads to increased presentation of the proteins involved. These findings suggested CDK4/6i provided a tool for highly selective induction of HLA ligands that may be targeted by T cell-based immunotherapeutics. Translational Relevance These data demonstrated that low-dose treatment of breast cancer cells with CDK4/6 inhibitors, Abemaciclib and Palbociclib, induced marked changes in presentation of HLA ligands, especially from proteins involved in the G1/S phase transition, the phase in which these drugs arrest the cells. Enhanced ubiquitination and degradation was identified as a mechanism for the altered presentation for one of the relevant proteins. The induced HLA ligands may provide ideal specific targets for combination immunotherapies. The data show for the first time that selective inhibition of a distinct pathway can lead to specific presentation of HLA ligands in breast cancer cells. This work supports the rationale for testing the combination of low-dose CDK4/6i with immunotherapeutic agents, such as immune checkpoint blockade antibodies or T-cell-based approaches specifically directed against one of the induced HLA ligands.

Abstract Genetically engineered, cytotoxic, adoptive T cells localize to antigen positive cancer cells inside patients, but tumor heterogeneity and multiple immune escape mechanisms have prevented the eradication of most solid tumor types. More effective, multifunctional engineered T cells are in development to overcome the barriers to the treatment of solid tumors, but the interactions of these highly modified cells with the host are poorly understood. We previously engineered prodrug-activating enzymatic functions into chimeric antigen receptor (CAR) T cells, endowing them with an orthogonal killing mechanism to conventional T-cell cytotoxicity. These drug-delivering cells, termed Synthetic Enzyme-Armed KillER (SEAKER) cells, demonstrated efficacy in mouse lymphoma xenograft models. However, the interactions of an immunocompromised xenograft with such complex engineered T cells are distinct from those in an immunocompetent host, precluding an understanding of how these physiologic processes may affect the therapy. Here, we also expand the repertoire of SEAKER cells to target solid-tumor melanomas in syngeneic mouse models using specific targeting with TCR-engineered T cells. We demonstrate that SEAKER cells localize specifically to tumors, and activate bioactive prodrugs, despite host immune responses. We additionally show that TCR-engineered SEAKER cells are efficacious in immunocompetent hosts, demonstrating that the SEAKER platform is applicable to many adoptive cell therapies.

Abstract Biological tubes serve as conduits through which gas, nutrients and other important fluids are delivered to tissues. Most biological tubes consist of multiple cells connected by epithelial junctions. Unlike these multicellular tubes, seamless tubes are unicellular and lack junctions. Seamless tubes are present in various organ systems, including the vertebrate vasculature, C . elegans excretory system, and Drosophila tracheal system. The Drosophila tracheal system is a network of air-filled tubes that delivers oxygen to all tissues. Specialized cells within the tracheal system, called terminal cells, branch extensively and form seamless tubes. Terminal tracheal tubes are polarized; the lumenal membrane has apical identity whereas the outer membrane exhibits basal characteristics. Although various aspects of membrane trafficking have been implicated in terminal cell morphogenesis, the precise secretory pathway requirements for basal and apical membrane growth have yet to be elucidated. In the present study, we demonstrate that anterograde trafficking, retrograde trafficking and Golgi-to-plasma membrane vesicle fusion are each required for the complex branched architecture of the terminal cell, but their inputs during seamless lumen formation are more varied. The COPII subunit, Sec 31, and ER exit site protein, Sec16, are critical for subcellular tube architecture, whereas the SNARE proteins Syntaxin 5, Syntaxin 1 and Syntaxin15 are required for seamless tube growth and maintenance. These data suggest that distinct components of the secretory pathway have differential contributions to basal and apical membrane growth and maintenance during terminal cell morphogenesis.

Abstract Exploring the repertoire of peptides presented on major histocompatibility complexes (MHC) has been utilized to identify targets for immunotherapy in many hematological malignancies. However, such data have not been described systematically for diffuse large B-cell lymphomas (DLBCL), which might be explained by the profound downregulation of MHC expression in many DLBCLs, and in particular in the EZH2-mutated subgroup. Epigenetic drug treatment, especially in the context of interferon gamma (IFNg), restored MHC expression in DLBCL. DLBCL MHC-presented peptides were identified via mass spectrometry following tazemetostat or decitabine treatments alone, or in combination with IFNg. Such treatment synergistically increased MHC class I surface protein expression up to 50-fold and class II expression up to 3-fold. Peptides presented on MHC complexes increased to a similar extent for MHC class I and remained constant for class II. Overall, these treatments restored the diversity of the immunopeptidome to levels described in healthy B cells and allowed the systematic search for new targets for immunotherapy. Consequently, we identified multiple MHC ligands from regulator of G protein signaling 13 (RGS13) and E2F transcription factor 8 (E2F8) on different MHC alleles, none of which have been described in healthy tissues and therefore represent tumor-specific MHC ligands, which are unmasked only after drug treatment. Overall, our results show that EZH2 inhibition in combination with decitabine and IFNg can expand the repertoire of MHC ligands presented on DLBCLs by revealing cryptic epitopes, thus allowing the systematic analysis and identification of new potential immunotherapy targets. Key points Combination therapy of interferon gamma with epigenetic regulators leads to large increases in the immunopeptidome of DLBCL. HLA ligands from proteins RGS13 and E2F8 may provide DLBCL-specific targets for immunotherapy.