ABSTRACT Efficient translation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) depends on implementing scalable cell manufacturing strategies that ensure optimal self-renewal and functional differentiation. Currently, manual culture of hiPSCs is highly variable and labor-intensive posing significant challenges for high-throughput applications. Here, we established a robotic platform and automated all essential steps of hiPSC culture and differentiation under chemically defined conditions. This streamlined approach allowed rapid and standardized manufacturing of billions of hiPSCs that can be produced in parallel from up to 90 different patient-and disease-specific cell lines. Moreover, we established automated multi-lineage differentiation to generate primary embryonic germ layers and more mature phenotypes such as neurons, cardiomyocytes, and hepatocytes. To validate our approach, we carefully compared robotic and manual cell culture and performed molecular and functional cell characterizations (e.g. bulk culture and single-cell transcriptomics, mass cytometry, metabolism, electrophysiology, Zika virus experiments) in order to benchmark industrial-scale cell culture operations towards building an integrated platform for efficient cell manufacturing for disease modeling, drug screening, and cell therapy. Combining stem cell-based models and non-stop robotic cell culture may become a powerful strategy to increase scientific rigor and productivity, which are particularly important during public health emergencies (e.g. opioid crisis, COVID-19 pandemic).

Abstract Bacterial type IV secretion systems (T4SSs) are macromolecular machines that translocate effector proteins across multiple membranes into infected host cells. Loss of function mutations in genes encoding protein components of the T4SS render bacteria avirulent, highlighting the attractiveness of T4SSs as drug targets. Here, we designed an automated high-throughput screening approach for the identification of compounds that interfere with the delivery of a reporter-effector fusion protein from Legionella pneumophila into RAW264.7 mouse macrophages. Using a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based detection assay in a bacteria/macrophage co-culture format, we screened a library of over 18,000 compounds and, upon vetting compound candidates in a variety of in vitro and cell-based secondary screens, isolated several hits that efficiently interfered with biological processes that depend on a functional T4SS, such as intracellular bacterial proliferation or lysosomal avoidance, but had no detectable effect on L. pneumophila growth in culture medium, conditions under which the T4SS is dispensable. Notably, the same hit compounds also attenuated, to varying degrees, effector delivery by the closely related T4SS from Coxiella burnetii , notably without impacting growth of this organism within synthetic media. Together, these results support the idea that interference with T4SS function is a possible therapeutic intervention strategy, and the emerging compounds provide tools to interrogate at a molecular level the regulation and dynamics of these virulence-critical translocation machines. Importance Multi-drug-resistant pathogens are an emerging threat to human health. Since conventional antibiotics target not only the pathogen but also eradicate the beneficial microbiota, they often cause additional clinical complications. Thus, there is an urgent need for the development of “smarter” therapeutics that selectively target pathogens without affecting beneficial commensals. The bacterial type IV secretion system (T4SS) is essential for the virulence of a variety of pathogens but dispensable for bacterial viability in general and can, thus, be considered a pathogen’s Achilles heel. By identifying small molecules that interfere with cargo delivery by the T4SS from two important human pathogens, Legionella pneumophila and Coxiella burnetii , our study represents the first step in our pursuit towards precision medicine by developing pathogen-selective therapeutics capable of treating the infections without causing harm to commensal bacteria.