RNA polymerase (Pol) III synthesizes abundant short noncoding RNAs that have essential functions in protein synthesis, secretion, and other processes. Despite the ubiquitous functions of these RNAs, mutations in Pol III subunits cause Pol III-related leukodystrophy, an early-onset neurodegenerative disease. The basis of this neural sensitivity and the mechanisms of disease pathogenesis are unknown. Here we show that mice expressing pathogenic mutations in the largest Pol III subunit, Polr3a, specifically in Olig2-expressing cells, have impaired growth and developmental delay, deficits in cognitive, sensory, and fine sensorimotor function, and hypomyelination in multiple regions of the cerebrum and spinal cord. These phenotypes reflect a subset of clinical features seen in patients. In contrast, the gross motor defects and cerebellar hypomyelination that are common features of severely affected patients are absent in the mice, suggesting a relatively mild form of the disease in this conditional model. Our results show that disease pathogenesis in the mice involves defects that reduce both the number of mature myelinating oligodendrocytes and the ability of these cells to produce a myelin sheath of normal thickness. The findings suggest unique sensitivities of oligodendrogenesis and myelination to perturbations of Pol III transcription.

Abstract Maf1 -/- mice are lean, obesity-resistant and metabolically inefficient. Their increased energy expenditure is thought to be driven by a futile RNA cycle that reprograms metabolism to meet an increased demand for nucleotides stemming from the deregulation of RNA polymerase (pol) III transcription. Metabolic changes consistent with this model have been reported in both fasted and refed mice, however the impact of the fasting-refeeding-cycle on pol III function has not been examined. Here we show that changes in pol III occupancy in the liver of fasted versus refed wild-type mice are largely confined to low and intermediate occupancy genes; high occupancy genes are unchanged. However, in Maf1 -/- mice, pol III occupancy of the vast majority of active loci in liver and the levels of specific precursor tRNAs in this tissue and other organs are higher than wild-type in both fasted and refed conditions. Thus, MAF1 functions as a chronic repressor of active pol III loci and can modulate transcription under different conditions. Our findings support the futile RNA cycle hypothesis, elaborate the mechanism of pol III repression by MAF1 and demonstrate a modest effect of MAF1 on global translation via reduced mRNA levels and translation efficiencies for several ribosomal proteins.

Abstract RNA polymerase (Pol) III synthesizes abundant short non-coding RNAs that have essential functions in protein synthesis, secretion and other processes. Despite the ubiquitous functions of these RNAs, mutations in Pol III subunits cause Pol III-related leukodystrophy, an early-onset neurodegenerative disease. The basis of this neural sensitivity and the mechanisms of disease pathogenesis are unknown. Here we show that mice expressing pathogenic mutations in the largest Pol III subunit, Polr3a , specifically in Olig2-expressing cells, have impaired growth and developmental delay, deficits in cognitive, sensory and fine sensorimotor function, and hypomyelination in multiple regions of the cerebrum and spinal cord. In contrast, the gross motor defects and cerebellar hypomyelination that are common features of severely affected patients are absent in the mice, suggesting a relatively mild form of the disease in this conditional model. Our results show that disease pathogenesis in the mice involves defects that reduce both the number of mature myelinating oligodendrocytes and the ability of these cells to produce a myelin sheath of normal thickness. Thus, the findings suggest cell-specific roles for Pol III in the development and/or survival of oligodendrocytes as well as their function in myelination. Significance Statement Pathogenic mutations in subunits of RNA polymerase (Pol) III cause a prevalent autosomal recessive form of leukodystrophy. However, understanding of the mechanisms of pathogenesis, including how ubiquitously-expressed Pol III mutations affect primarily the central nervous system, has been limited by the absence of an animal model of the disease. We show that conditional knock-in of pathogenic Polr3a mutations in the Olig2 lineage in mice results in growth, neurobehavioral and hypomyelination phenotypes reflecting a subset of clinical features of Pol III-related leukodystrophy patients. Myelination defects in the mice identify neural-specific roles for Pol III transcription. The phenotypes of Pol III-related leukodystrophic mice enable genetic and pharmacological approaches aimed at mitigating the consequences of this disease in humans.

Pathogenic variants in subunits of RNA polymerase (Pol) III cause a spectrum of neurodegenerative diseases including 4H leukodystrophy. Disease onset occurs from infancy to early adulthood and is associated with a variable range and severity of neurological and non-neurological features. The molecular basis of disease pathogenesis is unknown. We developed a postnatal whole-body mouse model expressing pathogenic Polr3a mutations to examine the molecular mechanisms by which reduced Pol III transcription results primarily in central nervous system phenotypes. Polr3a mutant mice exhibit behavioral deficits, cerebral pathology and exocrine pancreatic atrophy. Transcriptome and immunohistochemistry analyses of cerebra during disease progression show a reduction in most Pol III transcripts, induction of innate immune and integrated stress responses and cell type-specific gene expression changes reflecting neuron and oligodendrocyte loss and microglial activation. Earlier in the disease when integrated stress and innate immune responses are minimally induced, mature tRNA sequencing revealed a global reduction in tRNA levels and an altered tRNA profile but no changes in other Pol III transcripts. Thus, changes in the size and/or composition of the tRNA pool have a causal role in disease initiation. Our findings reveal different tissue- and brain region-specific sensitivities to a defect in Pol III transcription.

Pathogenic variants in subunits of RNA polymerase (Pol) III cause a spectrum of

Pathogenic variants in subunits of RNA polymerase (Pol) III cause a spectrum of neurodegenerative diseases including 4H leukodystrophy. Disease onset occurs from infancy to early adulthood and is associated with a variable range and severity of neurological and non-neurological features. The molecular basis of disease pathogenesis is unknown. We developed a postnatal whole-body mouse model expressing pathogenic Polr3a mutations to examine the molecular mechanisms by which reduced Pol III transcription results primarily in central nervous system phenotypes. Polr3a mutant mice exhibit behavioral deficits, cerebral pathology and exocrine pancreatic atrophy. Transcriptome and immunohistochemistry analyses of cerebra during disease progression show a reduction in most Pol III transcripts, induction of innate immune and integrated stress responses and cell type-specific gene expression changes reflecting neuron and oligodendrocyte loss and microglial activation. Earlier in the disease when integrated stress and innate immune responses are minimally induced, mature tRNA sequencing revealed a global reduction in tRNA levels and an altered tRNA profile but no changes in other Pol III transcripts. Thus, changes in the size and/or composition of the tRNA pool have a causal role in disease initiation. Our findings reveal different tissue- and brain region-specific sensitivities to a defect in Pol III transcription.

Maf1 is a highly conserved central regulator of transcription by RNA polymerase III (Pol III), and Maf1 activity influences a wide range of phenotypes from metabolic efficiency to lifespan. Here, we present a 3.3 Å cryo-EM structure of yeast Maf1 bound to Pol III, which establishes how Maf1 achieves transcription repression. In the Maf1-bound state, Pol III elements that are involved in transcription initiation are sequestered, and the active site is sealed off due to ordering of the mobile C34 winged helix 2 domain. Specifically, the Maf1 binding site overlaps with the binding site of the Pol III transcription factor TFIIIB and DNA in the pre-initiation complex, rationalizing that binding of Maf1 and TFIIIB to Pol III are mutually exclusive. We validate our structure using variants of Maf1 with impaired transcription-inhibition activity. These results reveal the exact mechanism of Pol III inhibition by Maf1, and rationalize previous biochemical data.

Abstract Mutations in RNA polymerase III (Pol III) cause hypomeylinating leukodystrophy (HLD) and neurodegeneration in humans. POLR3A and POLR3B, the two largest Pol III subunits, together form the catalytic center and carry the majority of disease alleles. Disease-causing mutations include invariant and highly conserved residues that are predicted to negatively affect Pol III activity and decrease transcriptional output. A subset of HLD missense mutations in POLR3A cluster in the pore region that provides nucleotide access to the Pol III active site. These mutations were engineered at the corresponding positions in the Saccharomyces cerevisiae homolog, Rpc160, to evaluate their functional deficits. None of the mutations caused a growth or transcription phenotype in yeast. Each mutation was combined with a frequently occurring pore mutation, POLR3A G672E, which was also wild-type for growth and transcription. The double mutants showed a spectrum of phenotypes from wild-type to lethal, with only the least fit combinations showing an effect on Pol III transcription. In one slow-growing temperature-sensitive mutant the steady-state level of tRNAs was unaffected, however global tRNA synthesis was compromised, as was the synthesis of RPR1 and SNR52 RNAs. Affinity-purified mutant Pol III was broadly defective in both factor-independent and factor-dependent transcription in vitro across genes that represent the yeast Pol III transcriptome. Thus, the robustness of yeast to Pol III leukodystrophy mutations in RPC160 can be overcome by a combinatorial strategy.

Pathogenic variants in subunits of RNA polymerase (Pol) III cause a spectrum of Polr3 -related neurodegenerative diseases including 4H leukodystrophy. Disease onset occurs from infancy to early adulthood and is associated with a variable range and severity of neurological and non-neurological features. The molecular basis of Polr3 -related disease pathogenesis is unknown. We developed a postnatal whole-body mouse model expressing pathogenic Polr3a mutations to examine the molecular mechanisms by which reduced Pol III transcription results primarily in central nervous system phenotypes. Polr3a mutant mice exhibit behavioral deficits, cerebral pathology and exocrine pancreatic atrophy. Transcriptome and immunohistochemistry analyses of cerebra during disease progression show a reduction in most Pol III transcripts, induction of innate immune and integrated stress responses and cell-type-specific gene expression changes reflecting neuron and oligodendrocyte loss and microglial activation. Earlier in the disease when integrated stress and innate immune responses are minimally induced, mature tRNA sequencing revealed a global reduction in tRNA levels and an altered tRNA profile but no changes in other Pol III transcripts. Thus, changes in the size and/or composition of the tRNA pool have a causal role in disease initiation. Our findings reveal different tissue- and brain region-specific sensitivities to a defect in Pol III transcription.