The start-up of the Linac Coherent Light Source (LCLS), the new femtosecond hard X-ray laser facility in Stanford, California, has brought high expectations of a new era for biological imaging. The intense, ultrashort X-ray pulses allow diffraction imaging of small structures before radiation damage occurs. Two papers in this issue of Nature present proof-of-concept experiments showing the LCLS in action. Chapman et al. tackle structure determination from nanocrystals of macromolecules that cannot be grown in large crystals. They obtain more than three million diffraction patterns from a stream of nanocrystals of the membrane protein photosystem I, and assemble a three-dimensional data set for this protein. Seibert et al. obtain images of a non-crystalline biological sample, mimivirus, by injecting a beam of cooled mimivirus particles into the X-ray beam. The start-up of the new femtosecond hard X-ray laser facility in Stanford, the Linac Coherent Light Source, has brought high expectations for a new era for biological imaging. The intense, ultrashort X-ray pulses allow diffraction imaging of small structures before radiation damage occurs. This new capability is tested for the problem of imaging a non-crystalline biological sample. Images of mimivirus are obtained, the largest known virus with a total diameter of about 0.75 micrometres, by injecting a beam of cooled mimivirus particles into the X-ray beam. The measurements indicate no damage during imaging and prove the concept of this imaging technique. X-ray lasers offer new capabilities in understanding the structure of biological systems, complex materials and matter under extreme conditions1,2,3,4. Very short and extremely bright, coherent X-ray pulses can be used to outrun key damage processes and obtain a single diffraction pattern from a large macromolecule, a virus or a cell before the sample explodes and turns into plasma1. The continuous diffraction pattern of non-crystalline objects permits oversampling and direct phase retrieval2. Here we show that high-quality diffraction data can be obtained with a single X-ray pulse from a non-crystalline biological sample, a single mimivirus particle, which was injected into the pulsed beam of a hard-X-ray free-electron laser, the Linac Coherent Light Source5. Calculations indicate that the energy deposited into the virus by the pulse heated the particle to over 100,000 K after the pulse had left the sample. The reconstructed exit wavefront (image) yielded 32-nm full-period resolution in a single exposure and showed no measurable damage. The reconstruction indicates inhomogeneous arrangement of dense material inside the virion. We expect that significantly higher resolutions will be achieved in such experiments with shorter and brighter photon pulses focused to a smaller area. The resolution in such experiments can be further extended for samples available in multiple identical copies.

Abstract Intestinal inflammation fuels Salmonella Typhimurium ( S .Tm) transmission despite a fitness cost associated with the expression of virulence. Cheater mutants can emerge that profit from inflammation without enduring this cost. Intestinal virulence in S .Tm is therefore a cooperative trait, and its evolution a conundrum. Horizontal gene transfer (HGT) of cooperative alleles may facilitate the emergence of cooperative virulence, despite its instability. To test this hypothesis, we cloned hilD , coding for a master regulator of virulence, into a conjugative plasmid that is highly transferrable during intestinal colonization. We demonstrate that virulence can emerge by hilD transfer between avirulent strains in vivo . However, this was indeed unstable and hilD mutant cheaters arose within a few days. The timing of cheater emergence depended on the cost. We further show that stabilization of cooperative virulence in S .Tm is dependent on transmission dynamics, strengthened by population bottlenecks, leading cheaters to extinction and allowing cooperators to thrive.

ABSTRACT Antimicrobial resistance (AMR) continues to evolve as a major threat to human health and new strategies are required for the treatment of AMR infections. Bacteriophages (phages) that kill bacterial pathogens are being identified for use in phage therapies, with the intention to apply these bactericidal viruses directly into the infection sites in bespoke phage cocktails. Despite the great unsampled phage diversity for this purpose, an issue hampering the roll out of phage therapy is the poor quality annotation of many of the phage genomes, particularly for those from infrequently sampled environmental sources. We developed a computational tool called STEP 3 to use the “evolutionary features” that can be recognized in genome sequences of diverse phages. These features, when integrated into an ensemble framework, achieved a stable and robust prediction performance when benchmarked against other prediction tools using phages from diverse sources. Validation of the prediction accuracy of STEP 3 was conducted with high-resolution mass spectrometry analysis of two novel phages, isolated from a watercourse in the Southern Hemisphere. STEP 3 provides a robust computational approach to distinguish specific and universal features in phages to improve the quality of phage cocktails, and is available for use at http://step3.erc.monash.edu/ . IMPORTANCE In response to the global problem of antimicrobial resistance there are moves to use bacteriophages (phages) as therapeutic agents. Selecting which phages will be effective therapeutics relies on interpreting features contributing to shelf-life and applicability to diagnosed infections. However, the protein components of the phage virions that dictate these properties vary so much in sequence that best estimates suggest failure to recognize up to 90% of them. We have utilised this diversity in evolutionary features as an advantage, to apply machine learning for prediction accuracy for diverse components in phage virions. We benchmark this new tool showing the accurate recognition and evaluation of phage components parts using genome sequence data of phages from under-sampled environments, where the richest diversity of phage still lies.

Abstract Environmental cues modulate the expression of virulence in bacterial pathogens. However, while cues that upregulate virulence are often intuitive and mechanistically well understood, this is less so for cues that downregulate virulence. In this study, we noticed that upregulation of the HilD virulence regulon in Salmonella Typhimurium ( S .Tm) sensitized cells to membrane stress mediated by cholate, Tris/EDTA or heat. Further monitoring of membrane status and stress resistance of S .Tm cells in relation to virulence expression, revealed that co-expressed virulence factors embedded in the envelope (including the Type Three Secretion System 1 and the flagella) increased permeability, and stress sensitivity of the membrane. Importantly, pretreating the bacteria by sublethal stress inhibited virulence expression and restored stress resistance. As such, these results demonstrate a trade-off between virulence and stress resistance, which explains the downregulation of virulence expression in response to harsh environments in S .Tm.

Introductory paragraph The ability of gut bacterial pathogens to escape immunity by antigenic variation, particularly via changes to surface-exposed antigens, is a major barrier to immune clearance 1 . However, not all variants are equally fit in all environments 2, 3 . It should therefore be possible to exploit such immune escape mechanisms to direct an evolutionary trade-off. Here we demonstrated this phenomenon using Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium ( S. Tm). A dominant surface antigen of S. Tm is its O-antigen: A long, repetitive glycan that can be rapidly varied by mutations in biosynthetic pathways or by phase-variation 4, 5 . We quantified the selective advantage of O-antigen variants in the presence and absence of O-antigen specific IgA and identified a set of evolutionary trajectories allowing immune escape without an associated fitness cost in naïve mice. Through the use of oral vaccines, we rationally induced IgA responses blocking all of these trajectories, which selected for Salmonella mutants carrying deletions of the O-antigen polymerase wzyB. Due to their short O-antigen, these evolved mutants were more susceptible to environmental stressors (detergents, complement), predation (bacteriophages), and were impaired in gut colonization and virulence in mice. Therefore, a rationally induced cocktail of intestinal antibodies can direct an evolutionary trade-off in S. Tm. This lays the foundations for the exploration of mucosal vaccines capable of setting evolutionary traps as a prophylactic strategy.

ABSTRACT Antibiotic resistance is driven by selection, but how a bacterial strain’s evolutionary history shapes drug-resistance remains an open question. Here we reconstruct the genetic and evolutionary mechanisms of carbapenem resistance in a clinical isolate of Klebsiella . A combination of short and long read sequencing, machine learning, genetic and enzymatic analyses established that this carbapenem-resistant strain carries no carbapenemase-encoding genes. Genetic reconstruction of the resistance phenotype confirmed that two distinct genetic loci are necessary for the strain to acquire carbapenem resistance. Experimental evolution of the carbapenem-resistant strains in growth conditions without the antibiotic revealed that both loci confer a significant cost, and are readily lost by de novo mutation resulting in the rapid evolution of a carbapenem-sensitive phenotype. Thus, historical contingency - a patient’s treatment history - can shape the evolution of antibiotic resistance and suggests that the strategic combinations of antibiotics could direct the evolution of low-fitness, drug-resistant genotypes.

Phenotypic heterogeneity in bacteria can generate reversible resistance against various stressors, including predation by phages. This allows mixed populations of phenotypically resistant and sensitive bacteria to coexist with virulent phages. However, it remains unclear if these dynamics prevent the evolution of genetic resistance in bacteria and how they affect the evolution of phages. In this work, we focus on bistable alterations of the O-antigen (known as phase variation) in Salmonella Typhimurium (S.Tm) to study how heterogeneous phenotypic resistance affects phage-bacteria coevolution. Our findings reveal that phase variation allows a stable coexistence of S.Tm with a virulent T5-like phage in vitro. This coexistence is nevertheless short-lived when S.Tm and the phage interact within the intestinal tract of mice. In this context, the phage evolves to also infect phenotypically resistant S.Tm cells, incidentally altering infectivity on other Salmonella serovars. In return, the broader host range of the evolved phages drives the evolution of genetic resistance in S.Tm, which results in phage extinction. This work demonstrates that phenotypic heterogeneity profoundly influences the antagonistic coevolution of phages and bacteria, with outcomes intricately tied to the ecological context.