ABSTRACT The multi-component Smc5/6 complex plays a critical role in the resolution of recombination intermediates formed during mitosis and meiosis, and in the cellular response to replication stress. Using recombinant proteins, we have reconstituted a series of defined S. cerevisiae SMC5/6 complexes, visualised them by negative stain electron microscopy, and tested their ability to function as an ATPase. We find that only the six protein ‘holo-complex’ is capable of turning over ATP and that its activity is significantly increased by the addition of double-stranded DNA to reaction mixes. Furthermore, stimulation is wholly dependent on functional ATP-binding pockets in both Smc5 and Smc6. Importantly, we demonstrate that budding yeast Nse5/6 acts as a negative regulator of Smc5/6 ATPase activity, binding to the head-end of the complex to suppress turnover, irrespective of the DNA-bound status of the complex.

ABSTRACT The Smc5/6 complex plays an essential role in the resolution of recombination intermediates formed during mitosis or meiosis, or as a result of the cellular response to replication stress. It also functions as a restriction factor preventing viral integration. Here, we report the cryo-EM structure of the six-subunit budding yeast Smc5/6 holo-complex, reconstituted from recombinant proteins expressed in insect cells – providing a full overview of the complex in its apo / non-liganded form, and revealing how the Nse1/3/4 subcomplex binds to the hetero-dimeric SMC protein core. In addition, we demonstrate that a region within the head domain of Smc5, equivalent to the ‘W-loop’ of Smc4 or ‘F-loop’ of Smc1, mediates an essential interaction with Nse1. Taken together, these data confirm a degree of functional equivalence between the structurally unrelated KITE and HAWK accessory subunits associated with SMC complexes.

ABSTRACT Activation of client protein kinases by the HSP90 molecular chaperone system is affected by phosphorylation at multiple sites on HSP90, on the kinase specific co-chaperone CDC37, and the kinase client itself. Removal of regulatory phosphorylation from client kinases and their release from the HSP90-CDC37 system depends on a Ser/Thr phosphatase PP5, which associates with HSP90 via its N-terminal TPR domain. Here we present the cryoEM structure of the oncogenic protein kinase client BRAF V600E bound to HSP90-CDC37, showing how the V600E mutation favours BRAF association with HSP90-CDC37. Structures of HSP90-CDC37-BRAF V600E complexes with PP5, in autoinhibited and activated conformations, together with proteomic analysis of its phosphatase activity, reveal how PP5 is activated by recruitment to HSP90 complexes to comprehensively dephosphorylate client proteins.

Grapevine fanleaf virus (GFLV) is a picorna-like plant virus transmitted by nematodes that affects vineyards worldwide. Nanobody (Nb)-mediated resistance against GFLV has been created recently and shown to be highly effective in plants including grapevine, but the underlying mechanism is unknown. Here we present the high-resolution cryo-EM structure of the GFLV-Nb23 complex which provides the basis for the molecular recognition by the nanobody. The structure reveals a composite binding site bridging over 3 domains of the capsid protein (CP) monomer. The structure provides a precise mapping of the Nb23 epitope on the GFLV capsid in which the antigen loop is accommodated through an induced fit mechanism. Moreover, we uncover and characterize several resistance-breaking GFLV isolates with amino acids mapping within this epitope, including C-terminal extensions of the CP, which would sterically interfere with Nb binding. Escape variants with such extended CP fail to be transmitted by nematodes linking Nb-mediated resistance to vector transmission. Together, these data provide insights into the molecular mechanism of Nb23-mediated recognition of GFLV and of virus resistance loss.