Abstract Thermophilic Methanothermobacter spp. are used as model microbes to study the physiology and biochemistry of the conversion of hydrogen and carbon dioxide into methane ( i.e ., hydrogenotrophic methanogenesis), because of their short doubling times and robust growth with high growth yields. Yet, a genetic system for these model microbes was missing despite intense work for four decades. Here, we report the establishment of tools for genetic modification of M. thermautotrophicus . We developed the modular Methanothermobacter vector system, which provided shuttle-vector plasmids (pMVS) with exchangeable selectable markers and replicons for both Escherichia coli and M. thermautotrophicus . For M. thermautotrophicus , a thermostable neomycin-resistance cassette served as the selectable marker for positive selection with neomycin, and the cryptic plasmid pME2001 from Methanothermobacter marburgensis served as the replicon. The pMVS-plasmid DNA was transferred from E. coli into M. thermautotrophicus via interdomain conjugation. After the successful validation of DNA transfer and positive selection in M. thermautotrophicus , we demonstrated heterologous gene expression of a thermostable β-galactosidase-encoding gene ( bgaB ) from Geobacillus stearothermophilus under the expression control of four distinct synthetic and native promoters. In quantitative in-vitro enzyme activity assays, we found significantly different β-galactosidase activity with these distinct promoters. With a formate dehydrogenase operon-encoding shuttle vector, we allowed growth of M. thermautotrophicus on formate as the sole growth substrate, while this was not possible for the empty vector control. These genetic tools provide the basis to investigate hypotheses from four decades of research on the physiology and biochemistry of Methanothermobacter spp. on a genetic level. Significance Statement The world economies are facing permanently increasing energy demands. At the same time, carbon emissions from fossil sources need to be circumvented to minimize harmful effects from climate change. The power-to-gas platform is utilized to store renewable electric power and decarbonize the natural gas grid. The microbe Methanothermobacter thermautotrophicus is already applied as the industrial biocatalyst for the biological methanation step in large-scale power-to-gas processes. To improve the biocatalyst in a targeted fashion, genetic engineering is required. With our shuttle-vector system for heterologous gene expression in M. thermautotrophicus , we set the cornerstone to engineer the microbe for optimized methane production, but also for production of high-value platform chemicals in power-to-x processes.

Abstract This study was continued by the Environmental Biotechnology Group of the University of Tübingen in memoriam to Reinhard Wirth, who initiated the work on Mth60 fimbriae at the University of Regensburg. Growth in biofilms or biofilm-like structures is the prevailing lifestyle for most microbes in nature. The first step to initiate biofilms is the adherence of microbes to biotic and abiotic surfaces. Therefore, it is important to elucidate the initial step of biofilm formation, which is generally established through cell-surface structures ( i.e ., cell appendages), such as fimbriae or pili, that adhere to surfaces. The Mth60 fimbriae of Methanothermobacter thermautotrophicus ΔH are one of only few known archaeal cell appendages that do not assemble via the type-IV assembly mechanism. Here, we report the constitutive expression of Mth60 fimbriae-encoding genes from a shuttle-vector construct, as well as the deletion of the Mth60 fimbriae-encoding genes from the genomic DNA of M. thermautotrophicus ΔH. We expanded our system for genetic modification of M. thermautotrophicus ΔH by an allelic-exchange method. While overexpression of the respective genes resulted in an increase of the Mth60 fimbriae, deletion of the Mth60 fimbriae-encoding genes led to a loss of Mth60 fimbriae in planktonic cells of M. thermautotrophicus ΔH. This either increased or decreased number of Mth60 fimbriae correlated with a significant increase or decrease of biotic cell-cell connections in the respective M. thermautotrophicus ΔH strains compared to the wild-type strain. Originality-Significance Statement Methanothermobacter spp. have been studied for the biochemistry of hydrogenotrophic methanogenesis for many years. However, due to the lack of genetic tools, the detailed investigation of certain aspects, such as regulatory processes, was not possible. Here, we amend our genetic toolbox for M. thermautotrophicus ΔH with an allelic exchange method. We report the deletion of genes that encode for the Mth60 fimbriae. Our findings provide a first insight into the regulation of the expression of these genes and reveal a role of the Mth60 fimbriae in the formation of cell-cell connections of M. thermautotrophicus ΔH.

Abstract Methanogenesis allows methanogenic archaea (methanogens) to generate cellular energy for their growth while producing methane. Hydrogenotrophic methanogens thrive on carbon dioxide and molecular hydrogen as sole carbon and energy sources. Thermophilic and hydrogenotrophic Methanothermobacter spp. have been recognized as robust biocatalysts for a circular carbon economy and are now applied in power-to-gas technology. Here, we generated the first manually curated genome-scale metabolic reconstruction for three Methanothermobacter spp‥ We investigated differences in the growth performance of three wild-type strains and one genetically engineered strain in two independent chemostat bioreactor experiments. In the first experiment, with molecular hydrogen and carbon dioxide, we found the highest methane production rate for Methanothermobacter thermautotrophicus ΔH, while Methanothermobacter marburgensis Marburg reached the highest biomass growth rate. Systems biology investigations, including implementing a pan-model that contains combined reactions from all three microbes, allowed us to perform an interspecies comparison. This comparison enabled us to identify crucial differences in formate anabolism. In the second experiment, with sodium formate, we found stable growth with an M. thermautotrophicus ΔH plasmid-carrying strain with similar performance parameters compared to wild-type Methanothermobacter thermautotrophicus Z-245. Our findings reveal that formate anabolism influences the diversion of carbon to biomass and methane with implications for biotechnological applications of Methanothermobacter spp. in power-to-gas technology and for chemical production. Graphical Abstract Broader context Renewable energy sources (e.g., wind and solar) provide carbon-free electric power. However, their intermittency and offset between peak production and demand generate the need to store this electric power. Furthermore, these technologies alone do not satisfy the demand for carbon-based commodities. Power-to-gas technology provides a means to store intermittent renewable electric power with concomitant carbon dioxide recycling into a chemical energy carrier, such as methane, on a centralized and decentralized scale. This is particularly important to establish equitable energy strategies for all countries, as is highlighted by the United Nations Sustainable Development Goals. With this work, we provide an integrated systems-biology platform for Methanothermobacter spp. to optimize biological power-to-gas technology and formulate strategies to produce other value-added products besides methane.

Abstract Clostridioides difficile infections often occur after antibiotic use, but they have also been linked to proton-pump inhibitor (PPI) therapy. The underlying mechanism—whether infection risk is due to a direct effect of PPIs on the gut microbiome or changes in gastrointestinal pH—has remained unclear. To disentangle both possibilities, we studied the impact of the proton-pump inhibitor omeprazole and pH changes on key members of the human gut microbiome and stool-derived microbial communities from different donors in vitro . We then developed a custom multiple-bioreactor system to grow a model human microbiome community in chemostat mode and tested the effects of omeprazole exposure, pH changes, and their combination on C. difficile growth within this community. Our findings show that changes in pH significantly affect the gut microbial community’s biomass and the abundances of different strains, leading to increased C. difficile growth within the community. However, omeprazole treatment alone did not result in such effects. These findings imply that the higher risk of C. difficile infection following proton-pump inhibitor therapy is probably because of alterations in gastrointestinal pH rather than a direct interaction between the drug and the microbiome. This understanding paves the way for reducing infection risks in proton-pump inhibitor therapy.

Biofuels, such as ethanol, can be produced by the microbial fermentation of waste gases that contain carbon dioxide (CO 2 ) and carbon monoxide (CO). The acetogenic model microbe Clostridium ljungdahlii converts those substrates into acetyl-CoA with the Wood-Ljungdahl pathway. During autotrophic conditions, acetyl-CoA can be reduced further to ethanol via acetic acid by the enzymes aldehyde:ferredoxin oxidoreductase (AOR) and alcohol dehydrogenase. Here, the genes encoding both tungsten-dependent AORs (aor1, CLJU_c20110 and aor2, CLJU_c20210) were deleted from the genome of C. ljungdahlii . Ethanol formation was enhanced for C. ljungdahlii Δaor1 with different carbon sources, that is, fructose, a mixture of hydrogen (H 2 ) and CO 2 , and CO. The highest and lowest ethanol:acetic acid ratio was detected during growth with H 2 /CO 2 and CO, respectively. Oscillating patterns were observed during growth with CO, underpinning the importance of a balanced redox metabolism.

Abstract For Clostridium ljungdahlii , the RNF complex plays a key role for energy conversion from gaseous substrates such as hydrogen and carbon dioxide. In a previous study, a disruption of RNF-complex genes led to the loss of autotrophy, while heterotrophy was still possible via glycolysis. Furthermore, it was shown that the energy limitation during autotrophy could be lifted by nitrate supplementation, which resulted in an elevated cellular growth and ATP yield. Here, we used CRISPR-Cas12a to delete: 1) the RNF complex-encoding gene cluster rnfCDGEAB ; 2) the putative RNF regulator gene rseC ; and 3) a gene cluster that encodes for a putative nitrate reductase. The deletion of either rnfCDGEAB or rseC resulted in a complete loss of autotrophy, which could be restored by plasmid-based complementation of the deleted genes. We observed a transcriptional repression of the RNF-gene cluster in the rseC -deletion strain during autotrophy and investigated the distribution of the rseC gene among acetogenic bacteria. To examine nitrate reduction and its connection to the RNF complex, we compared autotrophic and heterotrophic growth of our three deletion strains with either ammonium or nitrate. The rnfCDGEAB - and rseC -deletion strains failed to reduce nitrate as a metabolic activity in non-growing cultures during autotrophy but not during heterotrophy. In contrast, the nitrate reductase deletion strain was able to grow in all tested conditions but lost the ability to reduce nitrate. Our findings highlight the important role of the rseC gene for autotrophy and contribute to understand the connection of nitrate reduction to energy metabolism. Significance Statement Acetogenic bacteria are widely known for their ability to convert gaseous substrates, such as hydrogen, carbon dioxide, and carbon monoxide, into short-chain fatty acids and alcohols, which can be utilized as sustainable platform chemicals and fuels. However, acetogenic bacteria conserve energy at the thermodynamic limit of life during autotrophy, and thus the production of more complex and energy-dense chemicals is limited due to low ATP yields. Therefore, it is key to decipher the interplay of the electron balancing reactions to understand and optimize the acetogenic metabolism. Recent findings with alternative electron acceptors that accelerated the cellular growth and ATP yield during autotrophy, such as nitrate, provide an opportunity to overcome energetic barriers in the acetogenic metabolism. The interrogation of the nitrate metabolism and the interplay between nitrate reduction and energy conservation in C. ljungdahlii , will contribute to fine-tuning of the acetogenic metabolism for biotechnological applications.

The pH-value in fermentation broth has a large impact on the metabolic flux and growth behavior of acetogens. A decreasing pH level throughout time due to undissociated acetic acid accumulation is anticipated under uncontrolled pH conditions such as in bottle experiment. As a result, the impact of changes in the metabolism (e.g., due to a genetic modification) might remain unclear or even unrevealed. In contrast, pH-controlled conditions can be easily achieved in commercially available bioreactors. However, their acquisition is costly and their operation is time consuming, and therefore the experiment is often limited to a single bioreactor run. Here, we present a self-built, relatively cheap, and easy to handle open-source multiple-bioreactor system (MBS) consisting of six pH-controlled bioreactors at a 1-L scale. The functionality of the MBS was tested in three experiments by cultivating the acetogen Clostridium ljungdahlii with CO2 and H2 at steady-state conditions (=chemostat). The experiments were addressing the questions: (1) does the MBS provide replicable data for gas-fermentation experiments?; (2) does feeding acetate alter the production rate of ethanol; and (3) does feeding nitrate influence the product spectrum under controlled pH conditions with CO2 and H2? We applied four different periods in each experiment ranging from pH 6.0 to pH 4.5. Our data show high reproducibility for gas-fermentation experiments with C. ljungdahlii, using the MBS. We found that feeding acetate did not improve ethanol production, but rather impaired growth and reduced acetate production. Using nitrate as sole N-source, on the other hand, enhanced biomass production even at a low pH. However, we observed differences in growth, acetate, and ethanol production rates between triplicate bioreactors (n=3). We explained the different performances because of stochastic inhibition events, which we observed through the accumulation of nitrite, and which led to complete crashes at different operating times. One of these bioreactors recovered after the crash and showed enhanced ethanol production rates while simultaneously producing less acetate. The MBS offers a great opportunity to perform bench-scale bioreactor experiments at steady-state conditions with replicates, which is especially attractive for academia.

Acetogenic bacteria are rising in popularity as chassis microbes in biotechnology due to their capability of converting inorganic one-carbon (C1) gases to organic chemicals. To fully uncover the potential of acetogenic bacteria, synthetic-biology tools are imperative to either engineer designed functions or to interrogate the physiology. Here, we report a genome-editing tool at a one-nucleotide resolution, namely base editing, for acetogenic bacteria based on CRISPR-targeted deamination. This tool combines nuclease deactivated Cas9 with activation-induced cytidine deaminase to enable cytosine-to-thymine substitution without DNA cleavage, homology-directed repair, and donor DNA, which are generally the bottlenecks for applying conventional CRISPR-Cas systems in bacteria. We designed and validated a modularized base-editing tool in the model acetogenic bacterium Clostridium ljungdahlii. The editing principles were investigated, and an in-silico analysis revealed the capability of base editing across the genome. Moreover, genes related to acetate and ethanol production were disrupted individually by installing premature STOP codons to reprogram carbon flux towards improved acetate production. This resulted in engineered C. ljungdahlii strains with the desired phenotypes and stable genotypes. Our base-editing tool promotes the application and research in acetogenic bacteria and provides a blueprint to upgrade CRISPR-Cas-based genome editing in bacteria in general.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.