ABSTRACT Antibiotic resistance among bacterial pathogens poses a major global health threat. M. tuberculosis complex (MTBC) is estimated to have the highest resistance rates of any pathogen globally. Given the slow growth rate and the need for a biosafety level 3 laboratory, the only realistic avenue to scale up drug-susceptibility testing (DST) for this pathogen is to rely on genotypic techniques. This raises the fundamental question of whether a mutation is a reliable surrogate for phenotypic resistance or whether the presence of a second mutation can completely counteract its effect, resulting in major diagnostic errors (i.e. systematic false resistance results). To date, such epistatic interactions have only been reported for streptomycin that is now rarely used. By analyzing more than 31,000 MTBC genomes, we demonstrated that eis C-14T promoter mutation, which is interrogated by several genotypic DST assays endorsed by the World Health Organization, cannot confer resistance to amikacin and kanamycin if it coincides with loss-of-function (LoF) mutations in the coding region of eis . To our knowledge, this represents the first definitive example of antibiotic reversion in MTBC. Moreover, we raise the possibility that mmpR ( Rv0678 ) mutations are not valid markers of resistance to bedaquiline and clofazimine if these coincide with LoF mutation in the efflux pump encoded by mmpS5 ( Rv0677c ) and mmpL5 ( Rv0676c ).

Abstract Multidrug-resistant (MDR) and extensively drug resistant (XDR) Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) strains are a great challenge for tuberculosis (TB) control in India. Still, factors driving the MDR/XDR epidemic in India are not well defined. To address this, whole genome sequencing (WGS) data from 1 852 MTBC strains obtained from patients from a tertiary care hospital laboratory in Mumbai were used for phylogenetic strain classification, resistance prediction, and cluster analysis (12 allele distance threshold). Factors associated with pre-XDR/XDR-TB were defined by odds ratios and a multivariate logistic regression model. Overall, 1 017 MTBC strains were MDR, out of which 57.8 % (n=591) were pre-XDR, and 17.9 % (n=183) were XDR. Lineage 2 (L2) strains represented 41.7 % of the MDR, 77.2 % of the pre-XDR, and 86.3 % of the XDR strains, and were significantly associated with pre-XDR/XDR-TB (P < 0.001). Cluster rates were high among MDR (78 %) and pre-XDR/XDR (85 %) strains with three dominant L2 strain clusters (Cl 1-3) representing half of the pre-XDR and two thirds of the XDR-TB cases. Cl 1 strains accounted for 52.5 % of the XDR MTBC strains. Transmission could be confirmed by identical mutation patterns of particular pre-XDR/XDR strains. As a conclusion high rates of pre-XDR/XDR strains among MDR-TB patients require rapid changes in treatment and control strategies. Transmission of particular pre-XDR/XDR L2 strains is the main driver of the pre-XDR/XDR-TB epidemic. Accordingly, control of the epidemic in the region requires measures with stopping transmission especially of pre-XDR/XDR L2 strains.

Recent studies portend a rising global spread and adaptation of human- or healthcare-associated pathogens. Here, we analysed an international collection of the emerging, multidrug-resistant, opportunistic pathogen Stenotrophomonas maltophilia from 22 countries to infer population structure and clonality at a global level. We show that the S. maltophilia complex is divided into 23 monophyletic lineages, most of which harboured strains of all degrees of human virulence. Lineage Sm6 comprised the highest rate of human-associated strains, linked to key virulence and resistance genes. Transmission analysis identified potential outbreak events of genetically closely related strains isolated within days or weeks in the same hospitals.One Sentence Summary The S. maltophilia complex comprises genetically diverse, globally distributed lineages with evidence for intra-hospital transmission.

Altitudinal gradients represent short-range clines of environmental parameters like temperature, radiation, seasonality and pathogen abundance, which allows to study the footprints of natural selection in geographically close populations. We investigated phenotypic variation for frost resistance and light response in five Arabidopsis thaliana populations ranging from 580 to 2,350 meters altitude at two different valleys in the North Italian Alps. All populations were resequenced as pools and we used a Bayesian method to detect correlations between allele frequencies and altitude while accounting for sampling, pooled sequencing and the expected amount of shared drift among populations. The among population variation to frost resistance was not correlated with altitude. An anthocyanin deficiency causing a high leaf mortality was present in the highest population, which may be non-adaptive and potentially deleterious phenotypic variation. The genomic analysis revealed that the two high-altitude populations are more closely related than the geographically close low-altitude populations. A correlation of genetic variation with altitude revealed an enrichment of highly differentiated SNPs located in genes that are associated with biological processes like response to stress and light. We further identified regions with long blocks of presence absence variation suggesting a sweep-like pattern across populations. Our analysis indicate a complex interplay of local adaptation and a demographic history that was influenced by glaciation cycles and/or rapid seed dispersal by animals or other forces.

Whole genome sequencing (WGS) is becoming an important diagnostic tool for antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) isolates in many countries. WGS protocols usually start with the preparation of a DNA-library: the critical first step in the process. A DNA-library represents the genomic content of a DNA sample and consists of unique short DNA fragments. Although available DNA-library protocols come with manufacturer instructions, details of the entire process, including quality controls, instrument parameters, and run evaluations, often need to be developed and customized by each laboratory to implement WGS technology effectively. Here, we provide a detailed workflow for a DNA-library preparation based on an adapted Illumina protocol optimized for the reduction of reagent costs.

Whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) isolates has been shown to provide accurate predictions for resistance and susceptibility for many first- and second-line anti-tuberculosis drugs. However, bioinformatic pipelines and mutation catalogs to predict antimicrobial resistances in MTBC isolates are often customized and detailed protocols are difficult to access. Here, we provide a step-by-step workflow for the processing and interpretation of short-read sequencing data and give an overview of available analysis pipelines.