ABSTRACT The deposition of immunoglobulin light chains (IgLCs) in the form of amorphous aggregates or amyloid fibrils in different tissues of patients can lead to severe and potentially fatal organ damage, requiring transplantation in some cases. There has been great interest in recent years to elucidate the origin of the very different in vivo solubilities of IgLCs, as well as the molecular determinants that drive either the formation of ordered amyloid fibrils or disordered amorphous aggregates. It is commonly thought that the reason of this differential aggregation behaviour is to be found in the amino acid sequences of the respective IgLCs, i.e. that some sequences display higher intrinsic tendencies to form amyloid fibrils. Here we perform in depth Thermodynamic and Aggregation Fingerprinting (ThAgg-Fip) of 9 multiple myeloma patient-derived IgLCs, the amino acid sequences of all of which we have solved by de novo protein sequencing with mass spectrometry. The latter technique was also used for one IgLc from a patient with AL amyloidosis. We find that all samples also contain proteases that fragment the proteins under physiologically relevant mildly acidic pH conditions, leading to amyloid fibril formation in all cases. Our results suggest that while every pathogenic IgLC has a unique ThAgg fingerprint, all sequences have comparable amyloidogenic potential. Therefore, extrinsic factors, in particular presence of, and susceptibility to, proteolytic cleavage is likely to be a strong determinant of in vivo aggregation behaviour. The important conclusion, which is corroborated by systematic analysis of our sequences, as well as many sequences of IgLCs from amyloidosis patients reported in the literature, challenges the current paradigm of the link between sequence and amyloid fibril formation of pathogenic light chains.

Abstract ExbB and ExbD are cytoplasmic membrane proteins that associate with TonB to convey the energy of the proton-motive force to outer membrane receptors in Gram-negative bacteria for iron uptake. The opportunistic pathogen Serratia marcescens ( Sm ) possesses both TonB and a heme-specific TonB paralog, HasB. ExbB Sm has a long periplasmic extension absent in other bacteria such as E. coli (Ec) . Long ExbB’s are found in several genera of Alphaproteobacteria, most often in correlation with a hasB gene. We investigated specificity determinants of ExbB Sm and HasB. We determined the cryo-EM structures of ExbB Sm and of the ExbB-ExbD Sm complex from S. marcescens . ExbB Sm alone is a stable pentamer, and its complex includes two ExbD monomers. We showed that ExbB Sm extension interacts with HasB and is involved in heme acquisition and we identified key residues in the membrane domain of ExbB Sm and ExbB Ec , essential for function and likely involved in the interaction with TonB/HasB. Our results shed light on the new class of inner membrane energy machinery formed by ExbB,ExbD and HasB.

Abstract The Shigella effector IpaA co-opts the focal adhesion protein vinculin to promote bacterial invasion. Here, we show that IpaA triggers an unreported mode of vinculin activation through the cooperative binding of its three vinculin-binding sites (VBSs) leading to vinculin oligomerization via its D1 and D2 head subdomains and highly stable adhesions resisting actin relaxing drugs. Using cross-linking mass spectrometry, we found that while IpaA VBSs1-2 bound to D1, IpaA VBS3 interacted with D2, a subdomain masked to other known VBSs. Structural modeling indicated that as opposed to canonical activation linked to interaction with D1, these combined VBSs interactions triggered major allosteric changes leading to D1D2 oligomerization. A cysteine-clamp preventing these changes and D1D2 oligomerization impaired growth of vinculin microclusters and cell adhesion. We propose that D1D2-mediated vinculin oligomerization occurs during the maturation of adhesion structures to enable the scaffolding of high-order vinculin complexes, and is triggered by Shigella IpaA to promote bacterial invasion in the absence of mechanotransduction. Summary The Shigella IpaA effector binds to cryptic vinculin sites leading to oligomerization via its head domain. This vinculin oligomerization mode appears required for the maturation and strengthening of cell adhesion but is co-opted by invasive bacteria independent of actomyosin contractility.

Proteoforms, which arise from post-translational modifications, genetic polymorphisms and RNA splice variants, play a pivotal role as drivers in biology. Understanding proteoforms is essential to unravel the intricacies of biological systems and bridge the gap between genotypes and phenotypes. By analysing whole proteins without digestion, top-down proteomics (TDP) provides a holistic view of the proteome and can decipher protein function, uncover disease mechanisms and advance precision medicine. This Primer explores TDP, including the underlying principles, recent advances and an outlook on the future. The experimental section discusses instrumentation, sample preparation, intact protein separation, tandem mass spectrometry techniques and data collection. The results section looks at how to decipher raw data, visualize intact protein spectra and unravel data analysis. Additionally, proteoform identification, characterization and quantification are summarized, alongside approaches for statistical analysis. Various applications are described, including the human proteoform project and biomedical, biopharmaceutical and clinical sciences. These are complemented by discussions on measurement reproducibility, limitations and a forward-looking perspective that outlines areas where the field can advance, including potential future applications. Proteoforms can be investigated using top-down proteomics, a technique that analyses whole proteins without previous digestion. This Primer introduces top-down proteomics, exploring mass spectrometry experimental methods, sample preparation, data analysis and applications in understanding human disease.

Abstract Upon activation, vinculin reinforces cytoskeletal anchorage during cell adhesion. Activating ligands classically disrupt intramolecular interactions between the vinculin head and tail domain that binds to actin filaments. Here, we show that Shigella IpaA triggers major allosteric changes in the head domain leading to vinculin homo-oligomerization. Through the cooperative binding of its three vinculin-binding sites (VBSs), IpaA induces a striking reorientation of the D1 and D2 head subdomains associated with vinculin oligomerization. IpaA thus acts as a catalyst producing vinculin clusters that bundle actin at a distance from the activation site and trigger the formation of highly stable adhesions resisting the action of actin relaxing drugs. Unlike canonical activation, vinculin homo-oligomers induced by IpaA appear to keep a persistent imprint of the activated state in addition to their bundling activity, accounting for stable cell adhesion independent of force transduction and relevant to bacterial invasion.

Abstract Motivation We present a new software-tool allowing an easy visualization of fragment ions and thus a rapid evaluation of key experimental parameters on the sequence coverage obtained for the MS/MS analysis of intact proteins. Our tool can deal with multiple fragmentation methods. Results We demonstrate that TDFragMapper can rapidly highlight the experimental fragmentation parameters that are critical to the characterization of intact proteins of various size using top-down proteomics. Availability TDFragMapper, a demonstration video and user tutorial are freely available at https://msbio.pas-teur.fr/tdfragmapper , for academic use; all data are thus available from the ProteomeXchange consortium (identifier PXD024643). Contact diogobor@gmail.com or julia.chamot-rooke@pasteur.fr

Cytokinesis requires the constriction of ESCRT-III filaments on the side of the midbody, where abscission occurs. After ESCRT recruitment at the midbody, it is not known how the ESCRT-III machinery localizes to the abscission site. To reveal novel actors involved in abscission, we obtained the proteome of intact, post-abscission midbodies (Flemmingsome) and identified 489 proteins enriched in this organelle. Among those proteins, we further characterized a plasma membrane-to-ESCRT module composed of the transmembrane proteoglycan syndecan-4, ALIX and syntenin, a protein that bridges ESCRT-III/ALIX to syndecans. The three proteins were highly recruited first at the midbody then at the abscission site, and their depletion delayed abscission. Mechanistically, direct interactions between ALIX, syntenin and syndecan-4 were essential for proper enrichment of the ESCRT-III machinery at the abscission site, but not at the midbody. We propose that the ESCRT-III machinery must be physically coupled to a membrane protein at the cytokinetic abscission site for efficient scission, revealing novel common requirements in cytokinesis, exosome formation and HIV budding.

Lytic transglycosylases (LT) are redundant enzymes that play a critical role in peptidoglycan (PG) recycling and metabolism. LT(s) role in cell wall-modifying complexes and usefulness as antimicrobial drug targets remain elusive. We determined at high-resolution a structure of the membrane-bound homolog of the soluble LT from Neisseria species with a disordered active site helix (alpha helix 30). Alpha helix 30 is crucial for binding PG during catalysis1. Here we show using an alpha helix 30 deletion strain that LT (LtgA) determines the integrity of the cell wall, participates in cell division and separation, and can be manipulated to impair the fitness of the human pathogen Neisseria meningitidis during infection. Characterization of ltgA helix deleted strain interactome identified glycan chain synthesis and remodeling enzymes whose function appear to be modulated by LTs. Targeting LTs can disrupt the PG machinery, which is fatal for the bacterium, a new approach for antibiotic development.

The archaeal ribosome is of the eukaryotic type. Genomic and phylogenetic studies have indicated that TACK and Asgard, the closest relatives of eukaryotes, have ribosomes containing eukaryotic ribosomal proteins not found in other archaeal branches, eS25, eS26 and eS30. In our study, we investigated the case of Saccharolobus solfataricus, a crenarchaeon belonging to the TACK branch, which mainly uses leaderless mRNAs. We characterized the small ribosomal subunit of S. solfataricus bound to SD-leadered or leaderless mRNAs (lmRNAs). Cryo-EM structures show for the first time archaeal versions of eS25, eS26 and eS30 proteins bound to the small subunit. In addition, we identify two novel ribosomal proteins named aS33 and aS34 as well as a domain of eS6, that highlight the diversity of archaeal ribosomes. Leaderless mRNAs are bound to the small ribosomal subunit, and the 5'-triphosphate group contributes to their binding. Archaeal eS26 is in the mRNA exit channel wrapped around the 3' end of ribosomal RNA, as it is in eukaryotes. Its position is not compatible with an SD:antiSD duplex in the mRNA exit channel. Overall, our results suggest a role of eS26 in translation regulation and possible evolutionary routes from archaeal to eukaryotic translation.

ABSTRACT In antibody-based drug research, regulatory agencies request a complete characterization of antibody proteoforms covering both the amino acid sequence and all post-translational modifications. The usual mass spectrometry-based approach to achieve this goal is bottom-up proteomics, which relies on the digestion of antibodies, but does not allow the diversity of proteoforms to be assessed. Middle-down and top-down approaches have recently emerged as attractive alternatives but are not yet mastered and thus used in routine by many analytical chemistry laboratories. The work described here aims at providing guidelines to achieve the best sequence coverage for the fragmentation of intact light and heavy chains generated from a simple reduction of intact antibodies using Orbitrap mass spectrometry. Three parameters were found crucial to this aim: the use of an electron-based activation technique, the multiplex selection of precursor ions of different charge states and the combination of replicates.