Abstract Approaches to investigate adult oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) by targeted cell ablation in the rodent central nervous system have been limited by methodological challenges resulting in only partial and transient OPC depletion. We have developed a novel pharmacogenetic model of conditional OPC ablation, eliminating 98.6% of all OPCs throughout the brain. By combining recombinase-based transgenic and viral strategies for targeting OPCs and ventricular-subventricular zone (V-SVZ)-derived neural precursor cells (NPCs), we found new PDGFRA-expressing cells born in the V-SVZ repopulated the OPC-deficient brain starting 12 days after OPC ablation. Our data reveal that OPC depletion induces V-SVZ-derived NPCs to generate vast numbers of PDGFRA + NG2 + cells with the capacity to migrate and proliferate extensively throughout the dorsal anterior forebrain. Further application of this novel approach to ablate OPCs will advance knowledge of the function of both OPCs and oligodendrogenic NPCs in health and disease.

Abstract Myelin formation by oligodendrocytes regulates conduction velocity and functional integrity of neuronal axons. While individual oligodendrocytes form myelin sheaths around multiple axons and control the functions of neural circuits in the brains, it remains unclear if oligodendrocytes selectively form myelin sheaths around the specific types of axons. In this study, we developed a method for observing a single oligodendrocyte and its myelin sheaths around different types of axons in the mouse cerebellar white matter. This was achieved by combining sparse fluorescent labeling of oligodendrocytes by attenuated rabies virus and subsequent immunostaining for axonal markers along with tissue clearing. We revealed that approximately half of the oligodendrocytes showed a preferential myelination of axons originating from Purkinje cells in the adult mice. The preference for Purkinje cell axons was more pronounced during development, when the process of myelination within cerebellar white matter was initiated; over 90% of oligodendrocytes preferentially myelinated the Purkinje cell axons. The transgenic mice that label early born oligodendrocytes showed that their myelin sheaths were predominantly formed around Purkinje cell axons in the adult cerebellar white matter. These results suggest that a significant proportion of oligodendrocytes preferentially myelinate functionally distinct axons in the cerebellar white matter, and the axonal preference of myelination is established during development.

Single oligodendrocytes produce myelin sheath around multiple axons in the central nervous system. Interfascicular oligodendrocytes (IOs) in the white matter are aligned in rows and facilitate nerve conduction, but their detailed morphologies remain largely unknown. In the present study, we three-dimensionally reconstructed seven IOs in a row in the murine corpus callosum using serial block face-scanning electron microscopy (SBF-SEM). These morphologically polarized IOs extended a thick process with numerous branches from the cytoplasm-rich part of the cell and formed myelin sheaths preferentially around distant axons. The multiple branched processes of each IO myelinated multiple axons having similar diameters with restricted myelin thicknesses, indicating that individual IOs have their own myelination profiles even on distinct target neurons. Consistent with the finding, the IOs transduced and visualized with the rabies viral vector expressing GFP showed statistically significant variations in the myelination patterns. We further reconstructed the sheath immediately adjacent to those derived from the seven IOs; the thicknesses of both sheaths were significantly correlated despite emanating from different IOs. These results proposed a rule that myelination by individual IOs, regulated by interaction with ensheathed axons, is selective in specific axons and at the same time orchestrated at the whole cell level.

Abstract Molecular cloning techniques enabling contemporaneous expression of two or more protein-coding sequences in a cell type of interest provide an invaluable tool for understanding the molecular regulation of cellular functions. DNA recombination employing the Cre-lox system is commonly used as a molecular switch for inducing the expression of recombinant proteins encoded within a bicistronic cassette. In such an approach, the two protein-coding sequences are separated by a 2A peptide or internal ribosome entry site (IRES), and expression is designed to be strictly Cre-dependent by using a lox -STOP- lox cassette or flip-excision (FLEX) switch. However, low-level or ‘leaky’ expression of recombinant proteins is often observed in the absence of Cre activity, potentially compromising the utility of this approach. To investigate the mechanism of leaky gene expression, we generated pCAG-lox-GFP-STOP-lox-Transgene A-2A-Transgene B vectors, which are designed to express nuclear-targeted GFP in the absence of Cre, and express both transgenes A and B after Cre-mediated recombination. We found that cells transfected with these bicistronic vectors exhibited low-level Cre-independent expression specifically of the transgene positioned 3′ of the 2A peptide. We observed similar results in vivo by viral transduction of the adult mouse cerebral cortex with AAV-mutagenesis of putative transcription factor binding sites that the 5′ transgene confers promoter-like activity that drives expression of the 3′ transgene. Finally, we demonstrate that inclusion of an additional lox-STOP-lox cassette between the 2A sequence and 3′ transgene dramatically reduces the extent of Cre-independent leaky gene expression. Our findings highlight that caution should be applied to the use of Cre-dependent bicistronic constructs when tight regulation of transgene expression is desired and provide a guide to preventing leaky gene expression when the expression of more than one protein is required.

Molecular cloning techniques enabling contemporaneous expression of two or more protein-coding sequences provide an invaluable tool for understanding the molecular regulation of cellular functions. The Cre-lox system is used for inducing the expression of recombinant proteins encoded within a bi-/poly-cistronic cassette. However, leak expression of transgenes is often observed in the absence of Cre recombinase activity, compromising the utility of this approach. To investigate the mechanism of leak expression, we generated Cre-inducible bi-cistronic vectors to monitor the expression of transgenes positioned either 5' or 3' of a 2A peptide or internal ribosomal entry site (IRES) sequence. Cells transfected with these bi-cistronic vectors exhibited Cre-independent leak expression specifically of transgenes positioned 3' of the 2A peptide or IRES sequence. Similarly, AAV-