Ferroptosis, a non-apoptotic form of cell death marked by iron-dependent lipid peroxidation1, has a key role in organ injury, degenerative disease and vulnerability of therapy-resistant cancers2. Although substantial progress has been made in understanding the molecular processes relevant to ferroptosis, additional cell-extrinsic and cell-intrinsic processes that determine cell sensitivity toward ferroptosis remain unknown. Here we show that the fully reduced forms of vitamin K-a group of naphthoquinones that includes menaquinone and phylloquinone3-confer a strong anti-ferroptotic function, in addition to the conventional function linked to blood clotting by acting as a cofactor for γ-glutamyl carboxylase. Ferroptosis suppressor protein 1 (FSP1), a NAD(P)H-ubiquinone reductase and the second mainstay of ferroptosis control after glutathione peroxidase-44,5, was found to efficiently reduce vitamin K to its hydroquinone, a potent radical-trapping antioxidant and inhibitor of (phospho)lipid peroxidation. The FSP1-mediated reduction of vitamin K was also responsible for the antidotal effect of vitamin K against warfarin poisoning. It follows that FSP1 is the enzyme mediating warfarin-resistant vitamin K reduction in the canonical vitamin K cycle6. The FSP1-dependent non-canonical vitamin K cycle can act to protect cells against detrimental lipid peroxidation and ferroptosis.

Epstein-Barr virus (EBV) is a ubiquitous human herpesvirus linked to a number of B cell cancers and lymphoproliferative disorders. During latent infection, EBV expresses 25 viral pre-microRNAs (miRNAs) and induces the expression of specific host miRNAs, such as miR-155 and miR-21, which potentially play a role in viral oncogenesis. To date, only a limited number of EBV miRNA targets have been identified; thus, the role of EBV miRNAs in viral pathogenesis and/or lymphomagenesis is not well defined. Here, we used photoactivatable ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation (PAR-CLIP) combined with deep sequencing and computational analysis to comprehensively examine the viral and cellular miRNA targetome in EBV strain B95-8-infected lymphoblastoid cell lines (LCLs). We identified 7,827 miRNA-interaction sites in 3,492 cellular 3′UTRs. 531 of these sites contained seed matches to viral miRNAs. 24 PAR-CLIP-identified miRNA:3′UTR interactions were confirmed by reporter assays. Our results reveal that EBV miRNAs predominantly target cellular transcripts during latent infection, thereby manipulating the host environment. Furthermore, targets of EBV miRNAs are involved in multiple cellular processes that are directly relevant to viral infection, including innate immunity, cell survival, and cell proliferation. Finally, we present evidence that myc-regulated host miRNAs from the miR-17/92 cluster can regulate latent viral gene expression. This comprehensive survey of the miRNA targetome in EBV-infected B cells represents a key step towards defining the functions of EBV-encoded miRNAs, and potentially, identifying novel therapeutic targets for EBV-associated malignancies.

N 6 -methyladenine (m 6 A) is found on many eukaryotic RNAs including mRNAs. m 6 A modification has been implicated in mRNA stability and turnover, localization, or translation efficiency. A heterodimeric enzyme complex composed of METTL3 and METTL14 generates m 6 A on mRNAs. METTL3/14 is found in the nucleus where it is localized to nuclear speckles and the splicing regulator WTAP is required for this distinct nuclear localization pattern. Although recent crystal structures revealed how the catalytic MT-A70 domains of METTL3 and METTL14 interact with each other, a more global architecture including WTAP and RNA interactions has not been reported so far. Here, we used recombinant proteins and mapped binding surfaces within the METTL3/14-WTAP complex. Furthermore, we identify nuclear localization signals and identify phosphorylation sites on the endogenous proteins. Using an in vitro methylation assay, we confirm that monomeric METTL3 is soluble and inactive while the catalytic center of METTL14 is degenerated and thus also inactive. In addition, we show that the C-terminal RGG repeats of METTL14 are required for METTL3/14 activity by contributing to RNA substrate binding. Our biochemical work identifies characteristic features of METTL3/14-WTAP and reveals novel insight into the overall architecture of this important enzyme complex.

Article10 March 2020Open Access Enhancing protective microglial activities with a dual function TREM2 antibody to the stalk region Kai Schlepckow German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Search for more papers by this author Kathryn M Monroe Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Gernot Kleinberger orcid.org/0000-0002-5811-8226 Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Search for more papers by this author Ludovico Cantuti-Castelvetri German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Search for more papers by this author Samira Parhizkar Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Search for more papers by this author Dan Xia Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Michael Willem Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Search for more papers by this author Georg Werner Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Search for more papers by this author Nadine Pettkus Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Search for more papers by this author Bettina Brunner German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Search for more papers by this author Alice Sülzen German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Search for more papers by this author Brigitte Nuscher Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Search for more papers by this author Heike Hampel Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Search for more papers by this author Xianyuan Xiang Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Graduate School of Systemic Neuroscience, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Search for more papers by this author Regina Feederle orcid.org/0000-0002-3981-367X German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy), Munich, Germany Helmholtz Center Munich, German Research Center for Environmental Health, Institute for Diabetes and Obesity, Core Facility Monoclonal Antibody Development, Munich, Germany Search for more papers by this author Sabina Tahirovic orcid.org/0000-0003-4403-9559 German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Search for more papers by this author Joshua I Park Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Rachel Prorok Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Cathal Mahon Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Chun-Chi Liang Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Ju Shi Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Do Jin Kim Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Hanna Sabelström Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Fen Huang Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Gilbert Di Paolo Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Mikael Simons German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy), Munich, Germany Institute of Neuronal Cell Biology (TUM-NZB), Munich, Germany Search for more papers by this author Joseph W Lewcock Corresponding Author [email protected] orcid.org/0000-0003-3012-7881 Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Christian Haass Corresponding Author [email protected] orcid.org/0000-0002-4869-1627 German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy), Munich, Germany Search for more papers by this author Kai Schlepckow German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Search for more papers by this author Kathryn M Monroe Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Gernot Kleinberger orcid.org/0000-0002-5811-8226 Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Search for more papers by this author Ludovico Cantuti-Castelvetri German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Search for more papers by this author Samira Parhizkar Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Search for more papers by this author Dan Xia Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Michael Willem Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Search for more papers by this author Georg Werner Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Search for more papers by this author Nadine Pettkus Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Search for more papers by this author Bettina Brunner German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Search for more papers by this author Alice Sülzen German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Search for more papers by this author Brigitte Nuscher Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Search for more papers by this author Heike Hampel Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Search for more papers by this author Xianyuan Xiang Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Graduate School of Systemic Neuroscience, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Search for more papers by this author Regina Feederle orcid.org/0000-0002-3981-367X German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy), Munich, Germany Helmholtz Center Munich, German Research Center for Environmental Health, Institute for Diabetes and Obesity, Core Facility Monoclonal Antibody Development, Munich, Germany Search for more papers by this author Sabina Tahirovic orcid.org/0000-0003-4403-9559 German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Search for more papers by this author Joshua I Park Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Rachel Prorok Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Cathal Mahon Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Chun-Chi Liang Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Ju Shi Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Do Jin Kim Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Hanna Sabelström Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Fen Huang Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Gilbert Di Paolo Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Mikael Simons German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy), Munich, Germany Institute of Neuronal Cell Biology (TUM-NZB), Munich, Germany Search for more papers by this author Joseph W Lewcock Corresponding Author [email protected] orcid.org/0000-0003-3012-7881 Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA Search for more papers by this author Christian Haass Corresponding Author [email protected] orcid.org/0000-0002-4869-1627 German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy), Munich, Germany Search for more papers by this author Author Information Kai Schlepckow1,‡, Kathryn M Monroe2,‡, Gernot Kleinberger3,†,‡, Ludovico Cantuti-Castelvetri1, Samira Parhizkar3, Dan Xia2, Michael Willem3, Georg Werner3, Nadine Pettkus3, Bettina Brunner1, Alice Sülzen1, Brigitte Nuscher3, Heike Hampel3, Xianyuan Xiang3,4, Regina Feederle1,5,6, Sabina Tahirovic1, Joshua I Park2, Rachel Prorok2, Cathal Mahon2, Chun-Chi Liang2, Ju Shi2,†, Do Jin Kim2, Hanna Sabelström2, Fen Huang2, Gilbert Di Paolo2, Mikael Simons1,5,7, Joseph W Lewcock *,2 and Christian Haass *,1,3,5 1German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany 2Denali Therapeutics Inc., South San Francisco, CA, USA 3Metabolic Biochemistry, Biomedical Center (BMC), Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany 4Graduate School of Systemic Neuroscience, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany 5Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy), Munich, Germany 6Helmholtz Center Munich, German Research Center for Environmental Health, Institute for Diabetes and Obesity, Core Facility Monoclonal Antibody Development, Munich, Germany 7Institute of Neuronal Cell Biology (TUM-NZB), Munich, Germany †Present address: ISAR Bioscience GmbH, Planegg, Germany †Present address: Jazz Pharmaceuticals, Palo Alto, CA, USA ‡These authors contributed equally to this work *Correspondence: Tel: +1 (650) 745-5247; E-mail: [email protected] *Correspondence: Tel: +49 (0) 89-4400-46549; E-mail: [email protected] EMBO Mol Med (2020)12:e11227https://doi.org/10.15252/emmm.201911227 PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract Triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2) is essential for the transition of homeostatic microglia to a disease-associated microglial state. To enhance TREM2 activity, we sought to selectively increase the full-length protein on the cell surface via reducing its proteolytic shedding by A Disintegrin And Metalloproteinase (i.e., α-secretase) 10/17. We screened a panel of monoclonal antibodies against TREM2, with the aim to selectively compete for α-secretase-mediated shedding. Monoclonal antibody 4D9, which has a stalk region epitope close to the cleavage site, demonstrated dual mechanisms of action by stabilizing TREM2 on the cell surface and reducing its shedding, and concomitantly activating phospho-SYK signaling. 4D9 stimulated survival of macrophages and increased microglial uptake of myelin debris and amyloid β-peptide in vitro. In vivo target engagement was demonstrated in cerebrospinal fluid, where nearly all soluble TREM2 was 4D9-bound. Moreover, in a mouse model for Alzheimer's disease-related pathology, 4D9 reduced amyloidogenesis, enhanced microglial TREM2 expression, and reduced a homeostatic marker, suggesting a protective function by driving microglia toward a disease-associated state. Synopsis This study describes the discovery and characterization of a novel TREM2 antibody, which induces protective microglial functions and provides a basis for the development of human antibodies with a similar mechanistic profile for treatment of Alzheimer's disease. An antibody directed to the stalk region of TREM2 prevents its shedding and increases cell autonomous signaling. Addition of this TREM2 antibody to myeloid cells in vitro stimulates phagocytosis, and improves cell survival. TREM2 antibody treatment increases TREM2 expression on brain microglia, decreases homeostatic markers and reduces amyloid plaque pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. Antibody mediated stimulation of TREM2 signaling may be efficacious in Alzheimer's disease as well as other neurodegenerative disorders and obesity-associated metabolic syndromes. Introduction Alzheimer's disease (AD) and related disorders are devastating diseases threatening our aging society, and still, no cure is available. Since a number of recent clinical trials using amyloid β-peptide (Aβ)-based therapeutic approaches failed to improve cognition or even worsened the clinical outcome of patients (Egan et al, 2019), novel targets are desperately needed. Importantly, it appears that anti-Aβ therapeutics may have to be administered decades before symptom onset, since at the time patients are enrolled in clinical studies they are amyloid positron emission tomography (PET)-positive (Sevigny et al, 2016) even if they have not yet developed overt dementia. We therefore need to develop strategies to interfere with the amyloid cascade immediately after it has been initially triggered by Aβ and may become independent of its further de novo production. In addition to the selective deposition of amyloidogenic proteins, neuroinflammation associated with microgliosis is a common feature of many neurodegenerative disorders (Ransohoff, 2016). Recent genome-wide association studies strongly substantiated a central role of innate immunity for neurodegeneration by identifying a number of risk variants in genes that are exclusively expressed within microglia in the brain. Among them, coding variants in the triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2) increase the risk for late-onset AD as much as the apolipoprotein ε4 allele (Guerreiro et al, 2013; Jonsson & Stefansson, 2013; Jonsson et al, 2013; Rayaprolu et al, 2013; Borroni et al, 2014; Cuyvers et al, 2014). The disease-associated variants appear to cause a loss of function of TREM2 through a variety of mechanisms, including inhibition of cellular maturation of TREM2, destroying essential lipid binding sites within the immunoglobulin region of the ectodomain, and enhancing its shedding (Kleinberger et al, 2014, 2017; Mazaheri et al, 2017; Schlepckow et al, 2017; Ulland et al, 2017; Song et al, 2018). Full-length TREM2, in association with DAP12, forms a heteromeric complex required to activate phospho-SYK signaling (Colonna, 2003). Signaling appears to be terminated by α-secretase-mediated shedding of the TREM2 ectodomain (Fig 1A) (Wunderlich et al, 2013; Kleinberger et al, 2014), although very recent data suggest that soluble TREM2 (sTREM2) may also have signaling functions (Zhong et al, 2017, 2019), and requires further investigation. Loss of TREM2-mediated signaling locks microglia in a homeostatic state and inhibits their transition to disease-associated microglia (DAM) (Krasemann et al, 2017; Mazaheri et al, 2017), which are phenotypically characterized by enhanced migration, chemotaxis, and phagocytosis (Keren-Shaul et al, 2017; Mazaheri et al, 2017). Furthermore, lack of functional TREM2 appears to be associated with reduced cellular proliferation and death of phagocytes as well as reduced energy metabolism and cerebral blood flow in mice (Ulland et al, 2015, 2017; Kleinberger et al, 2017). TREM2 has been shown to be involved in lipid sensing, a function which is diminished by the AD-associated TREM2 R47H variant (Wang et al, 2015). Furthermore, loss of TREM2 results in downregulation of genes involved in lipid metabolism (Keren-Shaul et al, 2017; Griciuc et al, 2019). Consistent with these observations, TREM2 appears to be required for elimination of damaged myelin by microglia (Cantoni et al, 2015). Moreover, TREM2-deficient microglia were shown to be overloaded with cholesterol esters (CEs) as well as other lipid species as a result of chronic phagocytic challenge of myelin debris induced by a cuprizone diet (Nugent et al, 2019), indicating that TREM2 is important for lipid processing in addition to phagocytosis. Figure 1. Screening and molecular characterization of anti-mouse TREM2 antibodies Schematic representation of TREM2 processing by ADAM10/17. Cleavage occurs C-terminal of residue His 157. The entire ectodomain (residues 19–171) was used for immunization of rats to generate TREM2 antibodies. CTF, C-terminal fragment; sTREM2, soluble TREM2. Immunoblot analysis of membrane fractions of HEK293 Flp-In cells stably overexpressing both mouse TREM2 and mouse DAP12 upon treatment with 4D9 antibody reveals increased levels of membrane-bound TREM2 similar to what can be achieved by ADAM protease inhibition using the GM6001 inhibitor. An isotype antibody was used as a negative control. Calnexin served as a loading control. Levels of membrane-bound TREM2 were quantified by MSD ELISA. Data represent the mean ± SEM (n = 3). One-way ANOVA, Tukey's post hoc test; P (DMSO vs GM) = 0.0011; P (DMSO vs isotype) = 0.992; P (isotype vs 4D9) = 0.0005; n.s., not significant. Immunoblot analysis of conditioned media from HEK293 Flp-In cells stably overexpressing both mouse TREM2 and mouse DAP12 upon treatment with 4D9 antibody reveals decreased levels of sTREM2 similar to what can be achieved by ADAM protease inhibition using the GM6001 inhibitor. An isotype antibody was used as a negative control. sAPPα served as a loading control. Note that heavy and light chains of the antibodies used for treatment are also detected and annotated. Levels of sTREM2 were quantified by MSD ELISA. Data represent the mean ± SEM (n = 3). One-way ANOVA, Tukey's post hoc test; P (DMSO vs GM) < 0.0001; P (DMSO vs isotype) = 0.6372; P (isotype vs 4D9) < 0.0001; n.s., not significant. 4D9 antibody selectively detects TREM2 on the cell surface of HEK293 Flp-In cells stably overexpressing mouse TREM2 and mouse DAP12. An anti-HA antibody was used as a positive control, while empty vector-transfected HEK293 Flp-In cells were used as a negative control. Scale bar = 10 μm. Peptide ELISAs detect anti-mouse TREM2 antibody binding to tiled stalk region peptides, full-length stalk peptide, or a truncated ADAM cleavage site peptide. The binding epitope of 4D9 antibody is located 12-amino acids N-terminal of the ADAM cleavage site at His 157. Sequence comparison of mouse TREM2 and human TREM2 shows substantial sequence conservation around the 4D9 epitope (upper panel). Immunoblot analysis demonstrates that antibody 4D9 is highly specific for mouse TREM2 and does not detect human TREM2 or mouse TREM1 (lower panel). 4D9 binding to the mouse TREM2 ECD is competed off by a stalk region peptide. A competition ELISA demonstrates that a dose titration of stalk peptide reduces binding of 4D9 to TREM2 ECD with an EC50 of 1.3 μM. Data represent the mean ± SEM (n = 3). ECD, extracellular domain. Surface plasmon resonance binding kinetics of increasing concentrations of 4D9 antibody to mouse TREM2 ECD evaluated by Biacore, kon = 5.9 × 105 M−1 s−1, koff = 4.0 × 10−5 s−1, KD = 68 pM. 4D9 binding to human TREM2 or mouse TREM1 was undetectable. Data information: Statistical evaluations are displayed as follows: **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001. Source data are available online for this figure. Source Data for Figure 1 [emmm201911227-sup-0002-SDataFig1.pdf] Download figure Download PowerPoint Quantitative analyses of the cleaved sTREM2 ectodomain in the cerebrospinal fluid of patients with sporadic and autosomal dominant AD (ADAD) revealed enhanced levels at the mild cognitive impairment stage (Suarez-Calvet et al, 2016b, 2019) and up to 5 years before the estimated onset of ADAD (Suarez-Calvet et al, 2016a), respectively. Moreover, sTREM2 positively correlates with total tau and phospho-tau but not with Aβ (Suarez-Calvet et al, 2016b). Thus, CSF sTREM2 seems to be associated with tau pathology. Moreover, microglial activation and associated cellular functions are protective for cognition in a mouse model of AD (Focke et al, 2019), and ameliorate retinal degeneration (O'Koren et al, 2019). Furthermore, high levels of CSF sTREM2 predict a better outcome of cognition and reduced hippocampal shrinkage in the Alzheimer's disease neuroimaging initiative cohort (Ewers et al, 2019). Taken in combination with the observation that TREM2 loss of function increases AD risk, this suggests that enhancing TREM2 signaling represents a therapeutic strategy that is downstream of the initial Aβ-mediated trigger of the amyloid cascade. Since α-secretase-mediated shedding of TREM2 (Kleinberger et al, 2014; Schlepckow et al, 2017; Thornton et al, 2017) is sufficient to abrogate cell-autonomous signaling, we hypothesized that elevating TREM2 levels on the cell surface would enhance potentially disease-modulating microglial functions. Indeed, inhibition of α-secretase activity with a protease inhibitor enhanced the phagocytic capacity of microglial-like BV2 cells (Kleinberger et al, 2014). However, α-secretase competes with the amyloidogenic pathway and limits Aβ production (Haass & Selkoe, 1993); therefore, its inhibition in AD would be not be efficacious. Moreover, a disintegrin and metalloproteinase (ADAM, i.e., α-secretase) 10 and ADAM17 cleave numerous substrates within the brain, many of which stimulate essential physiological signaling pathways (Kuhn et al, 2016). We therefore sought to selectively inhibit TREM2 cleavage without affecting shedding of other ADAM10/17 substrates. We and others have previously identified the cleavage site of TREM2 after His 157 within the stalk region of TREM2 (Feuerbach et al, 2017; Schlepckow et al, 2017; Thornton et al, 2017) (Fig 1A). In this study, we screened for monoclonal antibodies binding to the stalk region encompassing the cleavage site with the purpose of stabilizing membrane-bound TREM2 and selectively enhancing TREM2-dependent protective functions in microglia. Results Screening and molecular characterization of anti-TREM2 antibodies To identify antibodies capable of increasing TREM2 on the cell surface, we raised monoclonal antibodies to the recombinantly expressed ectodomain of mouse TREM2 (amino acids 19–171; Fig 1A). Among the antibodies tested, 4D9, a rat IgG2a antibody, was selected for additional studies based on its ability to significantly enhance cell membrane TREM2 levels and to reduce sTREM2 levels similar to an ADAM protease inhibitor (Fig 1B and C). Immunohistochemistry showed that the 4D9 antibody bound to the cell surface of mouse TREM2-expressing HEK293 cells, while empty vector-expressing control cells did not show staining (Fig 1D). Antigen mapping using tiling peptides along the stalk region of TREM2 revealed specific binding of 4D9 to N-DAGDLWVPE, a 9-amino acid peptide N-terminal to the ADAM cleavage site (Fig 1E). Although this epitope shows substantial sequence similarities to human TREM2 (Fig 1F), 4D9 did not detect recombinant human TREM2 by Western blotting (Fig 1F). Furthermore, consistent with a lack of sequence conservation of the 9-amino acid region between mouse TREM1 and TREM2, 4D9 binding to mouse TREM1 was not detected (Fig 1F), demonstrating that 4D9 is indeed selective for mouse TREM2. To further confirm specific binding of 4D9 to the stalk region epitope, peptide competition experiments were performed. This demonstrated efficient competition of a TREM2 stalk peptide for 4D9 binding to the extracellular protein (Fig 1G). Antibody–antigen affinity was determined by surface plasmon resonance (SPR) demonstrating a monovalent KD of 68pM for mouse TREM2 (Fig 1H). Consistent with the Western blot data (see Fig 1F), human TREM2 and mouse TREM1 did not result in any SPR response (Fig 1H). High-affinity cell-surface TREM2 binding was established for 4D9 using HEK293 cells stably expressing TREM2. A dose response demonstrated a cell binding EC50 of 0.29 nM, while an isotype control antibody did not show measurable binding (Fig 2A). Next, we generated Fab fragments of 4D9, which specifically bound cell-surface TREM2 on HEK293 cells with an EC50 of 0.17 nM (Fig 2A). In vitro peptide cleavage assays using recombinant ADAM17 revealed that the full-length 4D9 antibody, as well as 4D9 Fab, significantly blocked cleavage of a TREM2 stalk peptide substrate (Fig 2B). Thus, 4D9 appears to sterically hinder access of ADAM17 to its substrate. However, in a cell-based assay, only full-length IgG 4D9 antibody, but not 4D9 Fab, potently reduced shedding of TREM2 in a dose-dependent manner with an EC50 of 2.3 nM (Fig 2C). Given that 4D9 reduced shedding and enhanced cell-surface levels of full-length TREM2, we next evaluated the effects on downstream signaling. We therefore investigated p-SYK activity in the presence or absence of 4D9 and an isotype control in HEK293 cells expressing mouse TREM2 and its signaling adapter DAP12. This revealed a dose-dependent increase in p-SYK upon addition of 4D9 but not 4D9 Fab to the culture media of the cells (Fig 2D). Furthermore, anionic liposome ligand (Shirotani et al, 2019) stimulated TREM2 signaling 2.3-fold by full-length 4D9 but not by 4D9 Fab or the isotype control (Fig 2E). These data therefore suggest that the monoclonal antibody 4D9 enhances TREM2-dependent signaling via bivalent binding which cross-links TREM2 on the plasma membrane. Bivalent TREM2 binding is required for both signaling and shedding blocking mechanisms of TREM2 antibody function, potentially as a result of the inability of proteases to accept dimeric substrates (Fig 2F). Figure 2. 4D9 antibody stimulates TREM2-dependent SYK signaling and blocks ADAM17-mediated TREM2 shedding Flow cytometry dose–response curve for cell binding of 4D9 mAb (EC50 = 0.29 nM), 4D9 Fab (EC50 = 0.17 nM), and isotype to HEK cells stably overexpressing mouse TREM2. Data represent the mean ± SEM (n = 2). In vitro ADAM17 sheddase activity is blocked by 4D9-effectorless mAb and 4D9 Fab fragment but not an isotype control. Fluorescence polarization of FAM-conjugated TREM2 stalk peptide was detected in the presence or absence of ADAM17 and 4D9 mAb, 4D9 Fab, and isotype control. Data represent the mean ± SEM (n = 6). One-way ANOVA, Tukey's post hoc test; P (4D9 Fab vs 4D9 mAb) = 0.8855; P (4D9 Fab vs uncleaved) < 0.0001; P (4D9 mAb vs uncleaved) < 0.0001; n.s., not significant. ELISA-mediated quantification of sTREM2 in conditioned media from HEK293 cells stably overexpressing mouse TREM2 treated with a dose titration of 4D9 mAb (EC50 = 2.3 nM), 4D9 Fab, or isotype for 18 h. Data represent the mean ± SEM (n = 3). AlphaLISA-mediated quantification of p-SYK levels in HEK293 Flp-In cells stably overexpressing mouse TREM2 and mouse DAP12 treated with a dose titration of 4D9 mAb, 4D9 Fab, or isotype for 5 min. Data represent the mean ± SEM (n = 3). AlphaLISA-mediated quantification of p-SYK levels in HEK293 Flp-In cells stably overexpressing mouse TREM2 and mouse DAP12 or empty vector treated with 1 mg/ml POPC/POPS liposomes and 20 μg/ml 4D9 mAb, 4D9 Fab, or isotype for 5 min. p-SYK levels were also determined for cells treated with liposomes only. Data represent the mean ± SEM (n = 3). Two-way ANOVA, Tukey's post hoc test (cell line effect: F1,16 = 365.7, P ≤ 0.0001; treatment effect: F3,16 = 39.35, P < 0.0001; cell line × treatment effect: F3,16 = 38.75, P < 0.0001); P (no Ab vs isotype) = 0.6218; P (no Ab vs 4D9 mAb) < 0.0001; P (no Ab vs 4D9 Fab) = 0.7301; P (isotype vs 4D9 mAb) < 0.0001; P (isotype vs 4D9 Fab) > 0.9999; P (4D9 mAb vs 4D9 Fab) < 0.0001; n.s., not significant. Schematic representation of the proposed mechanism of action of antibody 4D9. Binding of 4D9 to TREM2 leads to receptor clustering on the cell surface, thereby driving downstream p-SYK signaling. At the same time, cell-surface levels are enhanced by inhibition of ectodomain shedding, potentially because of the inability of proteases to cleave dimeric substrates. Data information: Statistical evaluations are displayed as follows: ***P < 0.001; ****P < 0.0001. Download figure Download PowerPoint 4D9 antibody modulates TREM2 function in primary macrophages and microglia We next investigated whether TREM2-dependent functions of myeloid cells can be modulated by 4D9. For these studies, 4D9 was sequenced and reformatted onto an effectorless human IgG1 backbone carrying mutations that abolish effector function to avoid confounds of off-target impact of FcR interactions on primary myeloid cells (for details, see Materials and Methods). To demonstrate that 4D9 binds endogenous cell-surface TREM2 in myeloid cells, bone marrow-derived macrophages (BMDMs) were incubated with biotinylated 4D9 or isotype control antibody. Cell-surface

Primary infection with the human oncogenic Epstein-Barr virus (EBV) can result in infectious mononucleosis (IM), a self-limiting disease caused by massive lymphocyte expansion that predisposes for the development of distinct EBV-associated lymphomas. Why some individuals experience this symptomatic primary EBV infection, whereas the majority acquires the virus asymptomatically, remains unclear. Using a mouse model with reconstituted human immune system components, we show that depletion of human natural killer (NK) cells enhances IM symptoms and promotes EBV-associated tumorigenesis mainly because of a loss of immune control over lytic EBV infection. These data suggest that failure of innate immune control by human NK cells augments symptomatic lytic EBV infection, which drives lymphocyte expansion and predisposes for EBV-associated malignancies.

Report30 August 2017Open Access Source DataTransparent process An Alzheimer-associated TREM2 variant occurs at the ADAM cleavage site and affects shedding and phagocytic function Kai Schlepckow Kai Schlepckow Biomedical Center (BMC), Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Search for more papers by this author Gernot Kleinberger Gernot Kleinberger orcid.org/0000-0002-5811-8226 Biomedical Center (BMC), Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy), Munich, Germany Search for more papers by this author Akio Fukumori Akio Fukumori German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Search for more papers by this author Regina Feederle Regina Feederle Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy), Munich, Germany German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Helmholtz Center Munich, German Research Center for Environmental Health, Institute for Diabetes and Obesity, Core Facility Monoclonal Antibody Development, Neuherberg, Germany Search for more papers by this author Stefan F Lichtenthaler Stefan F Lichtenthaler Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy), Munich, Germany German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Neuroproteomics, Klinikum Rechts der Isar, Technische Universität München, Munich, Germany Institute for Advanced Study, Technische Universität München, Garching, Germany Search for more papers by this author Harald Steiner Harald Steiner orcid.org/0000-0003-3935-0318 Biomedical Center (BMC), Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Search for more papers by this author Christian Haass Corresponding Author Christian Haass [email protected] orcid.org/0000-0002-4869-1627 Biomedical Center (BMC), Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy), Munich, Germany German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Search for more papers by this author Kai Schlepckow Kai Schlepckow Biomedical Center (BMC), Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Search for more papers by this author Gernot Kleinberger Gernot Kleinberger orcid.org/0000-0002-5811-8226 Biomedical Center (BMC), Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy), Munich, Germany Search for more papers by this author Akio Fukumori Akio Fukumori German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Search for more papers by this author Regina Feederle Regina Feederle Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy), Munich, Germany German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Helmholtz Center Munich, German Research Center for Environmental Health, Institute for Diabetes and Obesity, Core Facility Monoclonal Antibody Development, Neuherberg, Germany Search for more papers by this author Stefan F Lichtenthaler Stefan F Lichtenthaler Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy), Munich, Germany German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Neuroproteomics, Klinikum Rechts der Isar, Technische Universität München, Munich, Germany Institute for Advanced Study, Technische Universität München, Garching, Germany Search for more papers by this author Harald Steiner Harald Steiner orcid.org/0000-0003-3935-0318 Biomedical Center (BMC), Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Search for more papers by this author Christian Haass Corresponding Author Christian Haass [email protected] orcid.org/0000-0002-4869-1627 Biomedical Center (BMC), Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy), Munich, Germany German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany Search for more papers by this author Author Information Kai Schlepckow1, Gernot Kleinberger1,2, Akio Fukumori3,7, Regina Feederle2,3,4, Stefan F Lichtenthaler2,3,5,6, Harald Steiner1,3 and Christian Haass *,1,2,3 1Biomedical Center (BMC), Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany 2Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy), Munich, Germany 3German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Munich, Munich, Germany 4Helmholtz Center Munich, German Research Center for Environmental Health, Institute for Diabetes and Obesity, Core Facility Monoclonal Antibody Development, Neuherberg, Germany 5Neuroproteomics, Klinikum Rechts der Isar, Technische Universität München, Munich, Germany 6Institute for Advanced Study, Technische Universität München, Garching, Germany 7Present address: Department of Psychiatry, Osaka University Health Care Center, Toyonaka, Osaka, Japan *Corresponding author. Tel: +49 89 4400 46549; E-mail: [email protected] EMBO Mol Med (2017)9:1356-1365https://doi.org/10.15252/emmm.201707672 See also: P Thornton et al (October 2017) PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract Sequence variations occurring in the gene encoding the triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2) support an essential function of microglia and innate immunity in the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD) and other neurodegenerative disorders. TREM2 matures within the secretory pathway, and its ectodomain is shed on the plasma membrane. Missense mutations in the immunoglobulin (Ig)-like domain such as p.T66M and p.Y38C retain TREM2 within the endoplasmic reticulum and reduce shedding as well as TREM2-dependent phagocytosis. Using mass spectrometry, we have now determined the cleavage site of TREM2. TREM2 is shed by proteases of the ADAM (a disintegrin and metalloproteinase domain containing protein) family C-terminal to histidine 157, a position where an AD-associated coding variant has been discovered (p.H157Y) in the Han Chinese population. Opposite to the characterized mutations within the Ig-like domain, such as p.T66M and p.Y38C, the p.H157Y variant within the stalk region leads to enhanced shedding of TREM2. Elevated ectodomain shedding reduces cell surface full-length TREM2 and lowers TREM2-dependent phagocytosis. Therefore, two seemingly opposite cellular effects of TREM2 variants, namely reduced versus enhanced shedding, result in similar phenotypic outcomes by reducing cell surface TREM2. Synopsis The triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2) is shed on the cell surface by ADAM10 and ADAM17 between histidine 157 and serine 158, a site where the AD associated p.H157Y variant was found. p.H157Y increases shedding and impairs phagocytic function by lowering cell surface TREM2. The TREM2 ectodomain is cleaved by ADAM10/17 C-terminal to histidine 157. The late-onset AD-associated variant p.H157Y facilitates shedding and lowers cell surface mature TREM2. Decreased mature p.H157Y TREM2 on the cell surface reduces phagocytic activity. Introduction Inflammation and activation of brain-resident immune cells are common hallmarks of numerous neurological disorders. A pivotal role of microgliosis has been recognized since a long time specifically in neurodegenerative disorders (Lyman et al, 2014; Villegas-Llerena et al, 2016). A central role of microglial function in disease pathogenesis is now further supported by the identification of sequence variants and mutations in the triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (TREM2) that are associated with an increased risk for several neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease (AD), frontotemporal lobar degeneration (FTLD), Parkinson's disease, and FTLD-like syndrome (Guerreiro & Hardy, 2013; Guerreiro et al, 2013; Jonsson & Stefansson, 2013; Rayaprolu et al, 2013; Borroni et al, 2014; Cady et al, 2014; Cuyvers et al, 2014) and in a homozygous state cause Nasu–Hakola disease (Klunemann et al, 2005). In the brain, TREM2 is preferentially expressed in microglia and is functionally required for migration, cytokine release, phagocytosis, lipid sensing, ApoE binding, shielding of amyloid plaques, and microglia proliferation (Kleinberger et al, 2014; Atagi et al, 2015; Bailey et al, 2015; Colonna & Wang, 2016; Ulrich & Holtzman, 2016; Yeh et al, 2016; Yuan et al, 2016). TREM2 is a type-1 transmembrane protein that shuttles to the plasma membrane where it exerts its cell autonomous biological functions. TREM2 undergoes regulated intramembrane proteolysis (RIP) (Lichtenthaler et al, 2011; Wunderlich et al, 2013) (Fig 1A), which is initiated on the cell surface via shedding of full-length TREM2 by ADAM10 (a disintegrin and metalloproteinase domain containing protein) (Kleinberger et al, 2014). Shedding by ADAM10 results in the liberation of soluble TREM2 (sTREM2), which can be detected in human cerebrospinal fluid (CSF) (Kleinberger et al, 2014; Heslegrave et al, 2016; Piccio et al, 2016; Suarez-Calvet et al, 2016a,b). The membrane-retained C-terminal fragment (CTF) is subsequently cleared via an intramembranous cleavage by γ-secretase (Fig 1A) (Wunderlich et al, 2013; Glebov et al, 2016). So far several mutations have been functionally investigated. Mutations within the immunoglobulin (Ig)-like domain such as p.T66M and p.Y38C apparently result in misfolding of TREM2 and retention of the immature protein within the endoplasmic reticulum (Kleinberger et al, 2014; Park et al, 2015; Song et al, 2017) although upon strong transient overexpression mutant proteins may escape retention (Kober et al, 2016). As a consequence of misfolding, reduced cell surface levels of TREM2 are observed and shedding is dramatically lowered leading to reduced sTREM2 and TREM2 CTF levels (Kleinberger et al, 2014). Consistent with that, a patient with a homozygous TREM2 p.T66M mutation had extremely low or even no detectable sTREM2 in the CSF (Kleinberger et al, 2014; Piccio et al, 2016). Lowered cell surface TREM2 results in reduced phagocytic activity (Kleinberger et al, 2014). Although initially discrepant results regarding the effects of a loss of TREM2 function on amyloid plaque pathology were reported (Jay et al, 2015; Wang et al, 2015), TREM2 loss of function may lead to the accumulation of fuzzy amyloid plaques suggesting a lack of phagocytic clearance of the plaque halo or reduced prevention of amyloid plaque growth (Wang et al, 2016; Yuan et al, 2016). In support of reduced phagocytic plaque degradation, we showed recently that immunotherapeutic clearance of amyloid plaques via phagocytosis is reduced in the absence of TREM2 (Xiang et al, 2016). Figure 1. TREM2 is shed at a single cleavage site in the ectodomain between histidine 157 and serine 158 Regulated intramembrane proteolysis of TREM2. ADAM10 initiates proteolytic processing of TREM2 by liberating its ectodomain (sTREM2). Subsequent processing of the membrane retained C-terminal fragment (CTF) by γ-secretase within the transmembrane domain (TM) releases the intracellular domain (ICD) into the cytosol. A short p3-like peptide (Haass et al, 1993) may be secreted. Outline of strategy I for mass spectrometric (MS) determination of the N-terminal end of the TREM2 CTF enriched upon γ-secretase inhibition using DAPT. Western blot analysis of TREM2 stably expressed in HEK293 Flp-In cells upon γ-secretase inhibition using DAPT. Application of DAPT leads to a robust accumulation of the TREM2 CTF under constitutive conditions as well as upon phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) mediated stimulation of TREM2 ectodomain shedding. The TREM2 9D11 antibody raised against the TREM2 C-terminus was used to detect TREM2, and calnexin levels were analyzed as a loading control. Here, as in all other Western blots in Figs 1 and 2, the two lanes represent samples from two separate wells seeded at the same time. MALDI-TOF MS determination of the ectodomain cleavage site by immunoprecipitation of TREM2 CTF. The peak at 8,841.48 Da corresponds to a single cleavage site between histidine 157 and serine 158. Very minor additional peaks may represent cellular degradation products, as the N-terminal counterpart cannot be observed (see Fig 1I). Stimulation of ectodomain shedding by PMA leads to strong increases in sTREM2 (anti-HA, upper panel) and sAPPα (2D8, lower panel). DMSO served as a vehicle control. EV, empty vector control. MALDI-TOF MS determination of the ectodomain cleavage site upon ADAM17 stimulation using PMA. TREM2 CTFs were enriched by γ-secretase inhibition using DAPT (Fig 1C). The peak at 8,837.09 Da corresponds to a single cleavage site between histidine 157 and serine 158. Outline of strategy II for MS determination of the C-terminal end of sTREM2 generated by ectodomain shedding. Western blot analysis of full-length TREM2-TEVFlag (middle panel) and ectodomain shedding (upper panel) upon transient transfection of HEK293 Flp-In cells. EV, empty vector control. MALDI-TOF MS determination of the ectodomain cleavage site following the strategy outlined in Fig 1G. The peak at a mass of 3,947.78 Da corresponds to cleavage C-terminal of histidine 157 and is absent in cells transfected with an empty expression vector. TREM2 is shed predominantly C-terminal to histidine 157 as observed in two different cell types as well as under constitutive and PMA-stimulated conditions. Western blot analysis of full-length TREM2-TEVFlag (middle panel) and ectodomain shedding (upper panel) upon transient transfection of THP-1 monocytes. MALDI-TOF MS determination of the ectodomain cleavage site in THP-1 monocytes following the strategy outlined in Fig 1G. The peak at a mass of 3,943.80 Da corresponds to cleavage C-terminal of histidine 157 and is absent in cells transfected with an empty expression vector. Source data are available online for this figure. Source Data for Figure 1 [emmm201707672-sup-0001-SDataFig1.pdf] Download figure Download PowerPoint Most of the functionally investigated mutations are located within the Ig-like domain of TREM2. Misfolding of this domain, retention, and consequently reduced shedding appear to be a common readout of at least some of these variants. Although many sequence variants were found within the Ig-like domain, genetic studies also identified sequence variants within the stalk region and such mutants are unlikely to affect folding of the Ig-like domain. Since mutations in the stalk region may affect the efficacy and precision of ADAM-mediated shedding, we first determined the TREM2 cleavage site. Strikingly, ADAM-mediated cleavage within the stalk region occurs C-terminal to histidine 157 exactly where the AD-associated variant p.H157Y is located (Guerreiro et al, 2013; Ma et al, 2014; Jiang et al, 2016; Song et al, 2017). Analysis of proteolytic processing of the mutant variant revealed that higher levels of sTREM2 are generated, a finding opposite to the reduced shedding observed for mutations within the Ig-like domain such as p.T66M and p.Y38C (Kleinberger et al, 2014). However, enhanced shedding of TREM2 p.H157Y leads to reduced cell surface full-length TREM2 and hence to reduced phagocytic activity. Thus, mutations located within the Ig-like domain or the stalk region reduce surface expression of TREM2 and probably its signaling activity via completely different cellular mechanisms. Results and Discussion TREM2 is cleaved by ADAM proteases between histidine 157 and serine 158 To determine the cleavage site of TREM2, we followed two independent approaches. First, we determined the N-terminus of the membrane retained CTF remaining after shedding of the full-length precursor (Kleinberger et al, 2014). To do so, we expressed C-terminally Flag-tagged TREM2 (TREM2-CFlag) in human kidney 293 cells (HEK 293) (strategy I; Fig 1B). We enriched for the ADAM generated TREM2 CTF by inhibiting its γ-secretase-mediated intramembrane cleavage with DAPT (Dovey et al, 2001). Consistent with previous results (Wunderlich et al, 2013), Western blot analysis revealed a massive accumulation of the CTF upon γ-secretase inhibition (Fig 1C). Immunoprecipitation followed by mass spectrometry of the DAPT enriched CTF revealed one major peak corresponding to a molecular mass of 8,841.48 Da (Fig 1D; Table 1). This corresponds to a CTF with an N-terminus at serine 158 (see also Fig 1J). Additional very minor peaks may be due to proteolytic degradation of the CTF most likely within lysosomes. This is supported by the almost complete absence of such minor peaks in the analysis of the cleavage site of sTREM2 (see below). Table 1. Summary of identified peptides and comparison of observed masses to calculated masses. [M + H]+ indicates a singly charged peptide Peptide Cleavage Sequence Mass [M + H]+ (Da) Calculated Observed TREM2-CFlag WT (HEK) N-terminal of serine 158 (P1′) SISRSLLEGEIPF…DYKDDDDK 8,840.08 8,841.48 TREM2-CFlag WT (PMA, HEK) N-terminal of serine 158 (P1′) SISRSLLEGEIPF…DYKDDDDK 8,840.08 8,837.09 TREM2-CFlag p.H157Y (HEK) N-terminal of serine 158 (P1′) SISRSLLEGEIPF…DYKDDDDK 8,840.08 8,832.76 TREM2-TEVFlag (HEK) C-terminal of histidine 157 (P1) GDYKDDDDKLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEH 3,948.01 3,947.78 TREM2-TEVFlag (THP-1) C-terminal of histidine 157 (P1) GDYKDDDDKLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEH 3,948.01 3,943.80 So far ADAM10 has been described as the sole sheddase of TREM2 (Kleinberger et al, 2014). However, shedding is well known to be stimulated after protein kinase C activation. Under these conditions, shedding is predominantly performed by ADAM17 (Black, 2002; Saftig & Lichtenthaler, 2015). To prove whether TREM2 shedding can be stimulated similarly and whether cleavage still occurs at the same site, we treated HEK293 cells stably expressing TREM2-CFlag with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). This resulted in a robust increase in TREM2 shedding (Fig 1E). Similarly, and in line with previous results (Nitsch et al, 1992), shedding of the amyloid precursor protein (APP) was also stimulated (Fig 1E; lower panel). To determine the cleavage site of TREM2 after PMA-stimulated shedding, we again enriched for the CTF by γ-secretase inhibition (Fig 1C) followed by immunoprecipitation with an anti-Flag antibody. Mass spectrometry of the CTF revealed one major peak corresponding to a molecular mass of 8,837.09 Da (Fig 1F; Table 1). Thus, after PMA-stimulated TREM2 shedding, the proteolytic cleavage also occurs between histidine 157 and serine 158 (see also Fig 1J). To independently confirm the cleavage site, we introduced a TEV-protease cleavage site within the ectodomain of TREM2 after amino acid 132 followed by a Flag-tag (TREM2-TEVFlag; strategy II; Fig 1G) according to our previously described strategy for the identification of the cleavage site of presenilins (Fukumori et al, 2010). We first proved that such a modified TREM2 variant matures and undergoes shedding like unmodified TREM2. In cell lysates, full-length TREM2-TEVFlag was readily detected (Fig 1H; middle panel). HEK 293 cells expressing TREM2-TEVFlag also showed robust shedding of TREM2-TEVFlag (Fig 1H; upper panel), which is in line with the detection of the CTF in cell lysates (Fig 1H; middle panel). Next, sTREM2 was isolated by immunoprecipitation with an anti-Flag antibody and subsequently digested with TEV protease. Upon enrichment of the cleaved C-terminal peptide by anti-Flag immunoprecipitation (see Fig 1G), mass spectrometric analysis revealed a single sharp peak corresponding to a molecular mass of 3,947.78 Da, which was absent in conditioned media from HEK293 cells transfected with an empty expression vector (Fig 1I; Table 1). The observed molecular mass corresponds to a peptide terminating within the stalk region after histidine 157 (see also Fig 1J). Thus, both strategies independently identified one major cleavage site between histidine 157 and serine 158 (Fig 1J). Next, we investigated whether shedding also occurs in a human monocytic cell line at the same site. To do so, we transiently transfected TREM2-TEVFlag into THP-1 cells (Tsuchiya et al, 1980). TREM2-TEVFlag matures in THP-1 cells as in HEK293 cells and shedding of sTREM2 occurs as expected (Fig 1K). Following the same strategy as for HEK293 cells (see Fig 1G), mass spectrometric analysis revealed a single sharp peak corresponding to a molecular mass of 3,943.80 Da (Fig 1L; Table 1), which was absent in conditioned media from THP-1 cells transfected with an empty expression vector (Fig 1L; Table 1). The observed molecular mass corresponds to a peptide terminating within the stalk region after histidine 157 (see also Fig 1J), indicating the same TREM2 cleavage site in a human monocytic cell line. A disease-associated mutation at the cleavage site increases shedding The cleavage site of TREM2 after histidine 157 coincides with the p.H157Y late-onset AD-associated mutation recently described in the Han Chinese population (Ma et al, 2014; Jiang et al, 2016) (Fig 2A). Since it is well known that an AD-related mutation at the site of β-secretase-mediated shedding of APP pathologically affects APP proteolysis (Citron et al, 1992; Cai et al, 1993; Haass et al, 1995b; Thinakaran et al, 1996), we investigated proteolytic processing of TREM2 p.H157Y. Surprisingly, and opposite to the p.T66M and p.Y38C mutations, we found enhanced shedding of the p.H157Y mutant by Western blotting (Fig 2B). This was independently confirmed by anti-HA ELISA-mediated quantitation (Fig 2C). Since shedding of p.H157Y is significantly increased and the amino acid sequence is changed at the P1 site, we next asked whether the cleavage still occurs after amino acid 157. As described above, we enriched for the CTF produced from TREM2 p.H157Y via inhibition of γ-secretase by DAPT (see also Fig 2H). Mass spectrometry of the enriched CTF revealed one major peak corresponding to a molecular mass of 8,832.76 Da, which is consistent with a predominant cleavage after amino acid 157 (Fig 2D and E; Table 1). Thus, TREM2 p.H157Y is cleaved at the very same position as wild-type (wt) TREM2. Furthermore, TREM2 p.H157Y is also shed by members of the ADAM family, since the protease inhibitors GM6001 and GI254023X significantly reduce shedding (Fig 2F). Enhanced shedding of the p.H157Y variant is accompanied by reduced levels of mature fully glycosylated TREM2 (Fig 2G). Despite increased shedding and reduced mature TREM2, we surprisingly observed less CTFs suggesting enhanced degradation (Fig 2G). In line with that, the CTF derived from TREM2 p.H157Y is recovered after inhibition of γ-secretase cleavage (Fig 2H). Furthermore, additional expression of DAP12, which forms a tight complex with TREM2 (Paradowska-Gorycka & Jurkowska, 2013), prevents γ-secretase-dependent degradation of the p.H157Y TREM2 CTF (Fig. 2I). Enhanced shedding suggests reduced levels of TREM2 on the plasma membrane. Levels of cell surface mutant and wt TREM2 were determined by cell surface biotinylation. In line with our previous findings (Kleinberger et al, 2014), wt TREM2 was readily observed on the plasma membrane (Fig 2J). In contrast, p.H157Y could not be biotinylated on the cell surface similar to the previously investigated p.T66M mutant (Kleinberger et al, 2014) (Fig 2I). Thus, the histidine-to-tyrosine exchange at amino acid 157 increases shedding of mutant TREM2 and, as a consequence, reduces cell surface levels of the fully mature protein. Figure 2. A TREM2 sequence variant at the cleavage site leads to an increased shedding The TREM2 variant p.H157Y is located at the P1 site where shedding occurs via proteases of the ADAM family. In addition, the location of the p.T66M mutation within the Ig-like V-type domain is indicated. Increased shedding of TREM2 p.H157Y. Western blot analysis of conditioned media of HEK293 Flp-In cells stably transfected with cDNAs encoding HA and Flag-tagged wt TREM2 or TREM2 p.T66M and p.H157Y. Anti-HA antibody was used for detecting TREM2, and sAPPα levels were analyzed as a loading control. EV, empty vector control. ELISA-mediated quantitation of sTREM2 (Suarez-Calvet et al, 2016a) in conditioned media from HEK293 cells stably expressing wt TREM2 or TREM2 p.T66M and p.H157Y. Error bars indicate SEM of seven independent experiments. One-way ANOVA (with Dunnett's post hoc test against wt) was used for statistical analysis; wt versus EV: ***P < 0.0001; wt versus p.T66M: ***P < 0.0001; wt versus p.H157Y: **P = 0.002. MALDI-TOF MS analysis of the CTF derived from shedding of TREM2 p.H157Y identifies a single peak at a mass of 8,832.76 Da corresponding to a single cleavage site between tyrosine 157 and serine 158. TREM2 p.H157Y is shed predominantly C-terminal to tyrosine 157. Western blot analysis of TREM2 ectodomain shedding in the presence and absence of ADAM protease inhibitors. In line with previous findings (Kleinberger et al, 2014), the broad ADAM inhibitor (GM6001; left panel) and the more selective ADAM10 inhibitor (GI254023X; right panel) reduce shedding of wt TREM2, TREM2 p.H157Y as well as sAPPα. Western blot analysis of membrane fractions of HEK293 Flp-In cells stably expressing wt TREM2, TREM2 p.T66M, or TREM2 p.H157Y. The TREM2 9D11 antibody raised against the TREM2 C-terminus was used to detect TREM2, and calnexin levels were analyzed as a loading control. Western blot analysis of membrane fractions derived from cells stably expressing wt TREM2, TREM2 p.T66M, and TREM2 p.H157Y. γ-Secretase inhibition allows robust accumulation of the TREM2 CTF after shedding of TREM2 p.H157Y. Calnexin levels were analyzed as a loading control. Western blot analysis of membrane fractions derived from cells stably expressing wt TREM2, TREM2 p.T66M, and TREM2 p.H157Y together with or without transiently expressed human DAP12. Note that co-expression of human DAP12 allows the recovery of large amounts of the TREM2 p.H157Y CTF. Calnexin levels were analyzed as a loading control. Western blot analysis of cell surface biotinylated TREM2 reveals dramatically reduced levels of surface-exposed TREM2 p.H157Y, whereas robust amounts of cell surface wt TREM2 are detected. The anti-HA antibody was used to detect TREM2. Source data are available online for this figure. Source Data for Figure 2 [emmm201707672-sup-0002-SDataFig2.pdf] Download figure Download PowerPoint The disease-associated mutation reduces phagocytic activity Both the p.T66M and the p.H157Y mutations lead to reduced cell surface TREM2, albeit via opposite cellular mechanisms. Since the amount of cell surface TREM2 correlates with its cell autonomous function (Kleinberger et al, 2014; Song et al, 2017), we hypothesized that both mutations may result in a similar loss of function. To investigate TREM2-mediated function, we analyzed TREM2-dependent phagocytosis. In line with our previous findings (Kleinberger et al, 2014), wt TREM2 readily promoted uptake of Escherichia coli conjugated to pHrodo (Fig 3). Uptake was specific since treatment with cytochalasin D blocked engulfment of E. coli. Strikingly, cells expressing TREM2 p.H157Y exhibited a significantly reduced phagocytic capacity (Fig 3), demonstrating that this mutation at least affects phagocytic uptake of bacteria. Figure 3. The TREM2 variant p.H157Y impairs phagocytosisPhagocytic activity was measured using an E. coli pHrodo uptake assay. Cells were incubated with E. coli pHrodo particles for either 1 or 2 h (gray and black bars, respectively), and populations of phagocytically active cells were determined using flow cytometry. Cytochalasin D was used as a control. Data are shown as mean ± SD from four independent experiments (nEV(1 h) = 11, nWT(1 h) = 11, nEV(2 h) = 12, nWT(2 h) = 12) and three and two independent experiments for 1- and 2-h treatments, respectively (np.H157Y(1 h) = 8, np.H157Y(2 h) = 6). One-way ANOVA (with Tukey's post hoc test) was used for statistical analysis; EV versus WT (1 h): ***P = 0.0005; EV versus p.H157Y (1 h): P = 0.413; WT versus p.H157Y (1 h): *P = 0.0141; EV versus WT (2 h): ***P = 0.000014; EV versus p.H157Y (2 h): P = 0.071; WT versus p.H157Y (2 h): **P = 0.0031. Download figure Download PowerPoint Sequence variations of TREM2 have been found in all domains of the protein. However, most of the mutations occur within the Ig-like domain. At least some of the mutant proteins, such as p.T66M and p.Y38C, are likely to be misfolded and retained within the endoplasmic reticulum (Kleinberger et al, 2014; Park et al, 2015; Song et al, 2017). Therefore, these types of mutations reduce cell surface TREM2 and consequently the release of sTREM2, as shedding predominantly occurs on the plasma membrane. Consistent with reduced cell surface TREM2, biological functions of TREM2 such as lipid sensing, ApoE binding, and phagocytosis are all decreased by such mutations (Kleinberger et al, 2014; Atagi et al, 2015; Bailey et al, 2015; Yeh et al, 2016). Thus, for this class of mutations reduced release of sTREM2 may serve as a surrogate marker for reduced biological function. In line with that, a patient with a homozygous p.T66M mutation showed almost no sTREM2 in plasma and cerebrospinal fluid (Kleinberger et al, 2014; Piccio et al, 2016), and this mutation is known to severely affect TREM2 functions (Kleinberger et al, 2014; Yeh et al, 2016). A number of sequen

The increasing implication of lymphocytes in general physiology and immune surveillance outside of infection poses the question of how their antigen receptors might be involved. Here, we show that macromolecular aggregates of intraepidermal γδ T cell antigen receptors (TCRs) in the mouse skin aligned with and depended on Skint1, a butyrophilin-like (BTNL) protein expressed by differentiated keratinocytes (KCs) at steady state. Interruption of TCR-mediated 'normality sensing' had no impact on γδ T cell numbers but altered their signature phenotype, while the epidermal barrier function was compromised. In addition to the regulation of steady-state physiology, normality sensing licensed intraepidermal T cells to respond rapidly to subsequent tissue perturbation by using innate tumor necrosis factor (TNF) superfamily receptors. Thus, interfering with Skint1-dependent interactions between local γδ T cells and KCs at steady state increased the susceptibility to ultraviolet B radiation (UVR)-induced DNA damage and inflammation, two cancer-disposing factors.

Abstract Post-transcriptional gene regulation is complex, dynamic and ensures proper T cell function. The targeted transcripts can simultaneously respond to various factors as evident for Icos , an mRNA regulated by several RNA binding proteins (RBPs), including Roquin. However, fundamental information about the entire RBPome involved in post-transcriptional gene regulation in T cells is lacking. Here, we applied global RNA interactome capture (RNA-IC) and orthogonal organic phase separation (OOPS) to human and mouse primary T cells and identified the core T cell RBPome. This defined 798 mouse and 801 human proteins as RBPs, unexpectedly containing signaling proteins like Stat1, Stat4 and Vav1. Based on the vicinity to Roquin-1 in proximity labeling experiments, we selected ∼50 RBPs for testing coregulation of Roquin targets. Induced expression of these candidate RBPs in wildtype and Roquin-deficient T cells unraveled several Roquin-independent contributions, but also revealed Celf1 as a new Roquin-1-dependent and target-specific coregulator of Icos . One sentence statement We provide an atlas of RNA-binding proteins in human and mouse T helper cells as a resource for studying higher order post-transcriptional gene regulation.

Abstract The centromere, defined by the enrichment of CENP-A (a Histone H3 variant) containing nucleosomes, is a specialised chromosomal locus that acts as a microtubule attachment site. To preserve centromere identity, CENP-A levels must be maintained through active CENP-A loading during the cell cycle. A central player mediating this process is the Mis18 complex (Mis18α, Mis18ý and Mis18BP1), which recruits the CENP-A specific chaperone HJURP to centromeres for CENP-A deposition. Here, using a multi-pronged approach, we characterise the structure of the Mis18 complex and show that multiple hetero- and homo-oligomeric interfaces facilitate the hetero-octameric Mis18 complex assembly composed of 4 Mis18α, 2 Mis18ý and 2 Mis18BP1. Evaluation of structure-guided/separation-of-function mutants reveals structural determinants essential for Mis18 complex assembly and centromere maintenance. Our results provide new mechanistic insights on centromere maintenance, highlighting that while Mis18α can associate with centromeres and deposit CENP-A independently of Mis18ý, the latter is indispensable for the optimal level of CENP-A loading required for preserving the centromere identity.

The precise spatial and temporal control of histone phosphorylations is important for the ordered progression through the different phases of mitosis. The phosphorylation of H2B at S6 (H2B S6ph), which is crucial for chromosome segregation, reaches its maximum level during metaphase and is limited to the inner centromere. We discovered that the temporal and spatial regulation of this modification, as well as its intensity, are governed by the scaffold protein RepoMan and its associated catalytically active phosphatases, PP1α and PP1γ. Phosphatase activity is inhibited at the area of maximal H2B S6 phosphorylation at the inner centromere by site-specific Aurora B-mediated inactivation of the PP1/RepoMan complex. The motor protein Mklp2 contributes to the relocalization of Aurora B from chromatin to the mitotic spindle during anaphase, thus alleviating Aurora B-dependent repression of the PP1/RepoMan complex and enabling dephosphorylation of H2B S6. Accordingly, dysregulation of Mklp2 levels, as commonly observed in tumour cells, leads to the lack of H2B S6 dephosphorylation during early anaphase, which might contribute to chromosomal instability.