Abstract Systematic and extensive investigation of enzymes is needed to understand their extraordinary efficiency and meet current challenges in medicine and engineering. We present HT-MEK, a microfluidic platform for high-throughput expression, purification, and characterization of >1500 enzyme variants per experiment. For 1036 mutants of the alkaline phosphatase PafA, we performed >670,000 reactions to determine >5000 kinetic and physical constants for multiple substrates and inhibitors. These constants allowed us to uncover extensive kinetic partitioning to a misfolded state and isolate catalytic effects, revealing spatially contiguous “regions” of residues linked to particular aspects of function. These regions included active-site proximal residues but also extended to the enzyme surface, providing a map of underlying architecture that could not be derived from existing approaches. HT-MEK, using direct and coupled fluorescent assays, has future applications to a wide variety of problems ranging from understanding molecular mechanisms to medicine to engineering and design. One Sentence Summary HT-MEK, a microfluidic platform for high-throughput, quantitative biochemistry, reveals enzyme architectures shaping function.

ABSTRACT New high-throughput biochemistry techniques complement selection-based approaches and provide quantitative kinetic and thermodynamic data for thousands of protein variants in parallel. With these advances, library generation rather than data collection has become rate limiting. Unlike pooled selection approaches, high-throughput biochemistry requires mutant libraries in which individual sequences are rationally designed, efficiently recovered, sequence-validated, and separated from one another, but current strategies are unable to produce these libraries at the needed scale and specificity at reasonable cost. Here, we present a scalable, rapid, and inexpensive approach for creating U ser-designed P hysically I solated C lonal– M utant (uPIC–M) libraries that utilizes recent advances in oligo synthesis, high-throughput sample preparation, and next-generation sequencing. To demonstrate uPIC–M, we created a scanning mutant library of SpAP, a 541 amino acid alkaline phosphatase, and recovered 94% of desired mutants in a single iteration. uPIC–M uses commonly available equipment and freely downloadable custom software and can produce a 5000 mutant library at 1/3 the cost and 1/5 the time of traditional techniques.