High-throughput sequence (HTS) analysis of combinatorial selection populations accelerates lead discovery and optimization and offers dynamic insight into selection processes. An underlying principle is that selection enriches high-fitness sequences as a fraction of the population, whereas low-fitness sequences are depleted. HTS analysis readily provides the requisite numerical information by tracking the evolutionary trajectory of individual sequences in response to selection pressures. Unlike genomic data, for which a number of software solutions exist, user-friendly tools are not readily available for the combinatorial selections field, leading many users to create custom software. FASTAptamer was designed to address the sequence-level analysis needs of the field. The open source FASTAptamer toolkit counts, normalizes and ranks read counts in a FASTQ file, compares populations for sequence distribution, generates clusters of sequence families, calculates fold-enrichment of sequences throughout the course of a selection and searches for degenerate sequence motifs. While originally designed for aptamer selections, FASTAptamer can be applied to any selection strategy that can utilize next-generation DNA sequencing, such as ribozyme or deoxyribozyme selections, in vivo mutagenesis and various surface display technologies (peptide, antibody fragment, mRNA, etc.). FASTAptamer software, sample data and a user's guide are available for download at http://burkelab.missouri.edu/fastaptamer.html.

SUMMARY Breast milk secretory IgA antibodies provide a first line of defense against enteric infections. Despite this and an effective vaccine, human rotaviruses (RVs) remain the leading cause of severe infectious diarrhea in children in low- and middle-income countries (LMIC) where vaccine efficacy is lower than that of developed nations. Therapeutic strategies that deliver potently neutralizing antibodies into milk could provide protection against enteric pathogens such as RVs. We developed a murine model of maternal protective-transfer using systemic administration of a dimeric IgA (dIgA) monoclonal antibody. We confirmed that systemically-administered dIgA passively transferred into milk and stomach of suckling pups in a dose-dependent manner. We then demonstrated that systemic administration of an engineered potent RV-neutralizing dIgA (mAb41) in lactating dams protected suckling pups from RV-induced diarrhea. This maternal protective-transfer immunization platform could be an effective strategy to improve infant mortality against enteric infections, particularly in LMIC with high rates of breastfeeding. GRAPHICAL ABSTRACT

ABSTRACT Aptamer selections often yield distinct subpopulations, each with unique phenotypes that can be leveraged for specialized applications. RNA aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase (RT) exhibit potent RT inhibition and suppress viral replication when targeting the strain-specific RT that they were originally selected to bind, but some of these same aptamers fail against single-point mutant and phylogenetically-diverse RTs. We hypothesized that a subset of the total aptamer population in libraries pre-enriched against a single RT may exhibit broad-spectrum RT binding and inhibition, and we devised a multiplexed Poly-Target selection approach to elicit those phenotypes against a panel of diverse primate lentiviral RTs. High-throughput sequencing of starting, negative, and final libraries, followed by analysis of coenrichment and codepletion in parallel and duplicate selection trajectories, narrowed the list of candidate aptamers by orders of magnitude. Biochemical characterization of candidates identified a novel aptamer motif and several rare and unobserved variants of previously-known motifs that inhibited recombinant RTs from HIV-1, HIV-2 and SIV to varying degrees. These broad-spectrum aptamers also suppressed replication of viral constructs carrying phylogenetically-diverse RTs. The Poly-Target selection and coenrichment approach described herein is a generalizable strategy for identifying broad-spectrum behavior and cross-reactivity among related targets from combinatorial libraries.