Macroautophagy/autophagy is a conserved transport pathway where targeted structures are sequestered by phagophores, which mature into autophagosomes, and then delivered into lysosomes for degradation. Autophagy is involved in the pathophysiology of numerous diseases and its modulation is beneficial for the outcome of numerous specific diseases. Several lysosomal inhibitors such as bafilomycin A1 (BafA1), protease inhibitors and chloroquine (CQ), have been used interchangeably to block autophagy in in vitro experiments assuming that they all primarily block lysosomal degradation. Among them, only CQ and its derivate hydroxychloroquine (HCQ) are FDA-approved drugs and are thus currently the principal compounds used in clinical trials aimed to treat tumors through autophagy inhibition. However, the precise mechanism of how CQ blocks autophagy remains to be firmly demonstrated. In this study, we focus on how CQ inhibits autophagy and directly compare its effects to those of BafA1. We show that CQ mainly inhibits autophagy by impairing autophagosome fusion with lysosomes rather than by affecting the acidity and/or degradative activity of this organelle. Furthermore, CQ induces an autophagy-independent severe disorganization of the Golgi and endo-lysosomal systems, which might contribute to the fusion impairment. Strikingly, HCQ-treated mice also show a Golgi disorganization in kidney and intestinal tissues. Altogether, our data reveal that CQ and HCQ are not bona fide surrogates for other types of late stage lysosomal inhibitors for in vivo experiments. Moreover, the multiple cellular alterations caused by CQ and HCQ call for caution when interpreting results obtained by blocking autophagy with this drug.

Adult stem cells are the ultimate source for replenishment of salivary gland (SG) tissue. Self-renewal ability of stem cells is dependent on extrinsic niche signals that have not been unraveled for the SG. The ductal compartment in SG has been identified as the location harboring stem cells. Here, we report that rare SG ductal EpCAM(+) cells express nuclear β-catenin, indicating active Wnt signaling. In cell culture experiments, EpCAM(high) cells respond potently to Wnt signals stimulating self-renewal and long-term expansion of SG organoids, containing all differentiated SG cell types. Conversely, Wnt inhibition ablated long-term organoid cultures. Finally, transplantation of cells pre-treated with Wnt agonists into submandibular glands of irradiated mice successfully and robustly restored saliva secretion and increased the number of functional acini in vivo. Collectively, these results identify Wnt signaling as a key driver of adult SG stem cells, allowing extensive in vitro expansion and enabling restoration of SG function upon transplantation.

ABSTRACT Recent evidence indicated that HIV-1 Integrase (IN) binds genomic viral RNA (gRNA) playing a critical role in viral particle morphogenesis and gRNA stability in host cells. Combining biophysical and biochemical approaches we show that the C-terminal flexible 18-residues tail of IN acts as a sensor of the peculiar apical structure of trans-activation response element RNA (TAR), directly interacting with its hexaloop. We highlighted how the whole IN C-terminal domain, once bound to TAR, can change its structure assisting the binding of Tat, the HIV trans-activator protein, which finally displaces IN from TAR. Our results are consistent with the emerging role of IN in early stage of proviral transcription and suggest new steps of HIV-1 life cycle that can be considered as therapeutic targets.

Abstract The salivary glands often become damaged in individuals receiving radiotherapy for head and neck cancer, resulting in xerostomia, or chronic dry mouth. This leads to detrimental effects on their health and quality of life, for which there is no regenerative therapy. Macrophages are the predominant cell type in the salivary glands and are attractive therapeutic targets due to their unrivalled capacity to drive tissue repair and regeneration. Yet, the nature and role of macrophages in salivary gland homeostasis and whether or not they contribute to tissue repair/regeneration following injury is not well understood. Here, we have used single cell RNA-seq, multi-parameter flow cytometry and fluorescence microscopy to map the heterogeneity of the salivary gland macrophage compartment throughout development and following radiation-induced injury. We show that there are highly dynamic changes in the composition of the salivary gland macrophage compartment with age, in part due to changes in the ontogeny of these cells, determined using a suite of complementary fate mapping systems. A combination of mutant mice and antibody blockade demonstrates that salivary gland macrophages are dependent on CSF1, but not IL-34 or GM-CSF, for their development and maintenance. Finally, using an in vivo model of radiation-induced salivary gland injury combined with a novel Mafb -specific depletion system, we demonstrate an essential role for macrophages. Without macrophages the clearance of cells with DNA damage, and effective tissue repair following such injury, is severely comprised. Our data, therefore, indicate a strong case for exploring the therapeutic potential of manipulating macrophages in order to promote tissue repair and thus minimise salivary gland dysfunction after radiotherapy.

Abstract The nonsense-mediated mRNA decay (NMD) pathway triggers the degradation of defective mRNAs and governs the expression of mRNAs with specific characteristics. Current understanding indicates that NMD is often significantly suppressed during viral infections to protect the viral genome. In numerous viruses, this inhibition is achieved through direct or indirect interference with the RNA helicase UPF1, thereby promoting viral replication and enhancing pathogenesis. In this study, we employed biochemical, biophysical assays and cellular investigations to explore the interplay between UPF1 and the nucleocapsid (Np) protein of SARS-CoV-2. We evaluated their direct interaction and its impact on inhibiting cellular NMD. Furthermore, we characterized how this interaction affects UPF1’s enzymatic function. Our findings demonstrate that Np inhibits the unwinding activity of UPF1 by physically obstructing its access to structured nucleic acid substrates. Additionally, we showed that Np binds directly to UPF2, disrupting the formation of the UPF1/UPF2 complex essential for NMD progression. Intriguingly, our research also uncovered a surprising pro-viral role of UPF1 and an antiviral function of UPF2. These results unveil a novel, multi-faceted mechanism by which SARS-CoV-2 evades the host’s defenses and manipulates cellular components. This underscores the potential therapeutic strategy of targeting Np-UPF1/UPF2 interactions to treat COVID-19.