The analysis of cell-free DNA (cfDNA) in plasma represents a rapidly advancing field in medicine, providing information on pathological processes in the body. Blood cfDNA is in the form of nucleosomes, which maintain their tissue- and cancer-specific epigenetic state. We developed EPINUC, a single-molecule multi-parametric assay to comprehensively profile the E pigenetics of P lasma I solated Nuc leosomes, DNA methylation and cancer-specific protein biomarkers. Our system allows high-resolution detection of six active and repressive histone modifications, their ratios and combinatorial patterns, on millions of individual nucleosomes by single-molecule imaging. In addition, it provides sensitive and quantitative data on plasma proteins, including detection of non-secreted tumor-specific proteins such as mutant p53. Applying this analysis to a cohort of plasma samples detected colorectal cancer at high accuracy and sensitivity, even at early stages. Finally, combining EPINUC with direct single-molecule DNA sequencing revealed the tissue-of-origin of colorectal, pancreatic, lung and breast tumors. EPINUC provides multi-layered clinical-relevant information from limited liquid biopsy material, establishing a novel approach for cancer diagnostics.

Abstract Cancer-associated mutations in genes encoding histones dramatically reshape chromatin and support tumorigenesis. Lysine to methionine substitution of residue 27 on histone H3 (K27M) is a driver mutation in high-grade pediatric gliomas, known to abrogate Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) activity. We applied single-molecule systems to image individual nucleosomes and delineate the combinatorial epigenetic patterns associated with H3-K27M expression. We found that chromatin marks on H3-K27M-mutant nucleosomes are dictated both by their incorporation preferences and by intrinsic properties of the mutation. Mutant nucleosomes not only preferentially bind PRC2, but also directly interact with MLL1, thus leading to genome-wide redistribution of H3K4me3. H3-K27M-mediated deregulation of both repressive and active chromatin marks leads to unbalanced ‘bivalent’ chromatin, which may support a poorly differentiated cellular state. This study provides evidence for a direct effect of H3-K27M oncohistone on the MLL1-H3K4me3 pathway and highlights the capability of single-molecule tools to reveal mechanisms of chromatin deregulation in cancer.

Summary Cancer cells are highly heterogeneous at the transcriptional level and in their epigenetic state. Methods to study epigenetic heterogeneity are limited in throughput and information obtained per cell. Here, we adapted Cytometry by Time of Flight (CyTOF) to analyze a wide panel of histone modifications in primary tumor-derived lines of Diffused Intrinsic Pontine Glioma (DIPG). DIPG is a lethal glioma, driven by histone H3 lysine 27 mutation (H3-K27M). We identified two epigenetically distinct subpopulations in DIGP, reflecting inherent heterogeneity in expression of the mutant histone. These two subpopulations are robust across tumor lines derived from different patients and show differential proliferation capacity and expression of stem-cell and differentiation markers. Moreover, we demonstrate the use of this high-dimensional data to elucidate potential interactions between histone modifications and epigenetic alterations during the cell-cycle. Our work establishes new concepts for the analysis of epigenetic heterogeneity in cancer that could be applied to diverse biological systems.