Temporal dynamics in many biomolecular circuits can change with temperature because of the temperature dependence of underlying reaction rate parameters. It is generally unclear what circuit mechanisms can inherently facilitate robustness in the dynamics to variations in temperature. Here, we address this issue using a combination of mathematical models and experimental measurements in a cell-free transcription-translation system. We find that negative transcriptional feedback can reduce the effect of temperature variation on circuit dynamics. Further, we find that effective negative feedback due to first-order degradation mechanisms can also enable such a temperature robustness effect. Finally, we estimate temperature dependence of key parameters mediating such negative feedback mechanisms. These results should be useful in the design of temperature robust circuit dynamics.

The synthesis of RNA thermometers is aimed at achieving temperature responses with desired thresholds and sensitivities. Although previous works have generated thermometers with a variety of thresholds and sensitivities as well as guidelines for design, possible constraints in the achievable thresholds and sensitivities remain unclear. We addressed this issue using a two-state model and its variants, as well as melt profiles generated from thermodynamic computations. In the two-state model, we found that the threshold was inversely proportional to the sensitivity, in the case of a fixed energy difference between the two states. Notably, this constraint could persist in variations of the two-state model with sequentially unfolding states and branched parallel pathways. Furthermore, the melt profiles generated from a library of thermometers exhibited a similar constraint. These results should inform the design of RNA thermometers as well as other responses that are mediated in a similar fashion.

Abstract ‘Incoherent feedforward loops’ represent important biomolecular circuit elements capable of a rich set of dynamic behavior including adaptation and pulsed responses. Temperature can modulate some of these properties through its effect on the underlying reaction rate parameters. It is generally unclear how to design such a circuit where the properties are robust to variations in temperature. Here, we address this issue using a combination of tools from control and dynamical systems theory as well as preliminary experimental measurements towards such a design. We formalize temperature as an uncertainty acting on system dynamics, exploring both structured and unstructured uncertainty representations. Next, we analyze a standard incoherent feedforward loop circuit, noting mechanisms that intrinsically confer temperature robustness to some of its properties. Further, we explore different negative feedback configurations that can enhance the robustness to temperature. Finally, we find that the response of an incoherent feedforward loop circuit in cells can change with temperature. These results present groundwork for the design of a temperature-robust incoherent feedforward loop circuit.

Biomolecular temperature sensors can be used for efficient control of large-volume bioreactors, for spatiotemporal control and imaging of gene expression, as well as to engineer robustness to temperature in biomolecular circuit design. While RNA-based sensors, called 'thermometers', have been investigated in natural and synthetic contexts, an important challenge is to design different responses to temperature, differing in sensitivities and thresholds. We address this issue using experimental measurements in cells and in cell-free biomolecular 'breadboards' in combination with computations of RNA thermodynamics. We designed a library of RNA thermometers, finding, computationally, that it could contain a multiplicity of responses to temperature. We constructed this library and found a wide range of responses to temperature, ranging from 3.5-fold to over 10-fold in the temperature range 29°C - 37°C. These were largely linear responses with over 10-fold difference in slopes. We correlated the measured responses with computational expectations, finding that while there was no strong correlation in the individual values, the overall trends were similar. These results present a toolbox of RNA-based circuit elements with varying temperature sensitivities.

Abstract The synthesis of RNA thermometers is aimed at achieving temperature responses with desired thresholds and sensitivities. Although previous works have generated thermometers with a variety of thresholds and sensitivities as well as guidelines for design, possible constraints in the achievable thresholds and sensitivities remain unclear. We addressed this issue using a two-state model and its variants, as well as melt profiles generated from thermodynamic computations. In the two-state model, we found that the threshold was inversely proportional to the sensitivity, in the case of a fixed energy difference between the two states. Notably, this constraint could persist in variations of the two-state model with sequentially unfolding states and branched parallel pathways. Furthermore, the melt profiles generated from a library of thermometers exhibited a similar constraint. These results should inform the design of RNA thermometers as well as other responses that are mediated in a similar fashion.

Understanding constraints on the functional properties of biomolecular circuit dynamics, such as the variation of amplitude and timescale of pulse, is an important part of biomolecular circuit design. While the amplitude-timescale co-variations of the pulse in an incoherent feedforward loop have been investigated computationally using mathematical models, experimental support for such constraints is relatively unclear. Here, we address this using experimental measurements of an existing pulse generating incoherent feedforward loop circuit realization in the context of a standard mathematical model. We characterize the trends of co-variation in the pulse amplitude and rise time computationally by randomly exploring the parameter space. We experimentally measured the co-variation by varying inducers and found that larger amplitude pulses have slower rise time. We discuss the gap between the experimental measurements and predictions of the standard model, highlighting model additions and other biological factors that might bridge the gap.

Robustness to temperature variation is an important specification for biomolecular circuit design. While cancellation of parametric temperature dependences has been shown to improve temperature robustness of period in a synthetic oscillator design, the performance of other biomolecular circuit designs in different temperature conditions is relatively unclear. Using a combination of experimental measurements and mathematical models, we assess the temperature robustness of two biomolecular circuit motifs \---| a negative feedback loop and a feedforward loop. We find that the measured responses in both circuits can change with temperature, both in the amplitude and in the transient response. We find that, in addition to the cancellation of parametric temperature dependencies, certain parameter regimes can also facilitate temperature robustness for the negative feedback loop, although at a performance cost. We discuss these parameter regimes of operation in the context of the measured data for the negative feedback loop. These results should help develop a framework for assessing and designing temperature robustness in biomolecular circuits.