Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a hypoxia-inducible angiogenic growth factor that promotes compensatory angiogenesis in circumstances of oxygen shortage. The requirement for translational regulation of VEGF is imposed by the cumbersome structure of the 5' untranslated region (5'UTR), which is incompatible with efficient translation by ribosomal scanning, and by the physiologic requirement for maximal VEGF production under conditions of hypoxia, where overall protein synthesis is compromised. Using bicistronic reporter gene constructs, we show that the 1,014-bp 5'UTR of VEGF contains a functional internal ribosome entry site (IRES). Efficient cap-independent translation is maintained under hypoxia, thereby securing efficient production of VEGF even under unfavorable stress conditions. To identify sequences within the 5'UTR required for maximal IRES activity, deletion mutants were analyzed. Elimination of the majority (851 nucleotides) of internal 5'UTR sequences not only maintained full IRES activity but also generated a significantly more potent IRES. Activity of the 163-bp long "improved" IRES element was abrogated, however, following substitution of a few bases near the 5' terminus as well as substitutions close to the translation start codon. Both the full-length 5'UTR and its truncated version function as translational enhancers in the context of a monocistronic mRNA.

Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), an endothelial cell-specific mitogen and a potent angiogenic factor, is upregulated in response to a hypoxic or hypoglycemic stress. Here we show that the increase in steady-state levels of VEGF mRNA is partly due to transcriptional activation but mostly due to increase in mRNA stability. Both oxygen and glucose deficiencies result in extension of the VEGF mRNA half-life in a protein synthesis-dependent manner. Viewing VEGF as a stress-induced gene, we compared its mode of regulation with that of other stress-induced genes. Results showed that under nonstressed conditions, VEGF shares with the glucose transporter GLUT-1 a relatively short half-life (0.64 and 0.52 h, respectively), which is extended fourfold and more than eightfold, respectively, when cells are deprived of either oxygen or glucose. In contrast, the mRNAs of another hypoxia-inducible and hypoglycemia-inducible gene, grp78, as well as that of HSP70, were not stabilized by these metabolic insults. To show that VEGF and GLUT-1 are coinduced in differentially stressed microenvironments, multicell spheroids representing a clonal population of glioma cells in which each cell layer is differentially stressed were analyzed by in situ hybridization. Cellular microenvironments conducive to induction of VEGF and GLUT-1 were completely coincidental. These findings show that two different consequences of tissue ischemia, namely, hypoxia and glucose deprivation, induce VEGF and GLUT-1 expression by similar mechanisms. These proteins function, in turn, to satisfy the tissue needs through expanding its vasculature and improving its glucose utilization, respectively.

Ectopic lymphoid-like structures (ELSs) are often observed in cancer, yet their function is obscure. Although ELSs signify good prognosis in certain malignancies, we found that hepatic ELSs indicated poor prognosis for hepatocellular carcinoma (HCC). We studied an HCC mouse model that displayed abundant ELSs and found that they constituted immunopathological microniches wherein malignant hepatocyte progenitor cells appeared and thrived in a complex cellular and cytokine milieu until gaining self-sufficiency. The egress of progenitor cells and tumor formation were associated with the autocrine production of cytokines previously provided by the niche. ELSs developed via cooperation between the innate immune system and adaptive immune system, an event facilitated by activation of the transcription factor NF-κB and abolished by depletion of T cells. Such aberrant immunological foci might represent new targets for cancer therapy.

Although clonal neo-antigen burden is associated with improved response to immune therapy, the functional basis for this remains unclear. Here we study this question in a novel controlled mouse melanoma model that enables us to explore the effects of intra-tumor heterogeneity (ITH) on tumor aggressiveness and immunity independent of tumor mutational burden. Induction of UVB-derived mutations yields highly aggressive tumors with decreased anti-tumor activity. However, single-cell-derived tumors with reduced ITH are swiftly rejected. Their rejection is accompanied by increased T cell reactivity and a less suppressive microenvironment. Using phylogenetic analyses and mixing experiments of single-cell clones, we dissect two characteristics of ITH: the number of clones forming the tumor and their clonal diversity. Our analysis of melanoma patient tumor data recapitulates our results in terms of overall survival and response to immune checkpoint therapy. These findings highlight the importance of clonal mutations in robust immune surveillance and the need to quantify patient ITH to determine the response to checkpoint blockade.

Abstract Several long noncoding RNAs (lncRNA) are abrogated in cancer but their precise contributions to oncogenesis are still emerging. Here we report that the lncRNA MALAT1 is upregulated in hepatocellular carcinoma and acts as a proto-oncogene through Wnt pathway activation and induction of the oncogenic splicing factor SRSF1. Induction of SRSF1 by MALAT1 modulates SRSF1 splicing targets, enhancing the production of antiapoptotic splicing isoforms and activating the mTOR pathway by modulating the alternative splicing of S6K1. Inhibition of SRSF1 expression or mTOR activity abolishes the oncogenic properties of MALAT1, suggesting that SRSF1 induction and mTOR activation are essential for MALAT1-induced transformation. Our results reveal a mechanism by which lncRNA MALAT1 acts as a proto-oncogene in hepatocellular carcinoma, modulating oncogenic alternative splicing through SRSF1 upregulation. Cancer Res; 77(5); 1155–67. ©2016 AACR.

Abstract 2-hydroxyglutarate (2HG) is recognized as an epigenetic regulator in cancer and some transient biological processes. Of all organs, the testis harbors the highest baseline physiological levels of 2HG, yet it’s putative functions in germ cell biology are unknown. Here we show that 2HG is generated in specific stages of spermatogenesis by the testis specific lactate dehydrogenase C (LDHC), beginning at the last stages of prophase I. Unexpectedly LDHC enters nuclei and concentrates in centromeres. LDHC-generated L-2HG controls centromere condensation and pericentromeric heterochromatin organization through multiple effects including clustering of chromocenters, centromere and chromocenter condensation and expression of satellite RNAs. These effects are rapid and specific to L but not D-2HG. In vivo depletion of L-2HG causes centromere malfunction and activation of the spindle assembly checkpoint. Our findings reveal that 2HG can directly affect centromere and pericentromeric heterochromatin conformation and function and is necessary for licensing chromosome segregation.

Abstract Tertiary lymphoid structures (TLSs) are formed in many cancer types and have been correlated with better prognosis and response to immunotherapy. In liver cancer, TLSs have been reported to be pro-tumorigenic as they harbor tumor progenitor cells and nurture their growth. The processes involved in TLS development and the acquisition of a pro- or anti-tumorigenic phenotype in cancer are largely unknown. RORc expressing immune cells have been previously implicated in TLS formation, however we find that they are not necessary for TLS neogenesis in the context of inflammation-associated liver cancer. On the contrary, RORc expressing cells negatively regulate TLS formation, since in their absence TLSs form in excess. CD4 cells are essential for liver TLS formation whereas B cells are required for TLS formation specifically in the absence of RORc expressing cells. Importantly, in chronically inflamed livers lacking RORc expressing cells, TLSs become anti-tumorigenic, resulting in reduced tumor load. Comparing liver pro- and anti-tumorigenic TLSs by transcriptional, proteomic and immunohistochemical analyses, revealed enrichment of exhausted CD8 cells that retained effector functions as well as germinal center B cells and plasma cells in anti-tumorigenic TLSs. Cell depletion experiments revealed a role mainly for B cells in limiting tumor development, possibly via tumor directed antibodies. Thus, RORc expressing cells negatively regulate B cell responses, and facilitate the pro-tumorigenic functions of hepatic TLSs.