Abstract Actinobacteriophages of a wide range of genome sizes continue to be isolated and characterized, but only a handful of these have atypically small genomes, defined in this work as genome sizes under 20,000 bp. These “small phages” are relatively rare and have received minimal study thus far. Of the actinobacteriophages published in PhagesDB.org , small phages have been isolated on Arthrobacter , Gordonia , Rhodococcus , and Microbacterium hosts. A previous study by Pope et al . showed that Gordonia small phages have similar gene products and amino acid sequences. Here, we set out to further examine relationships between small Gordonia phages as well as small phages that infect other hosts. Of the 3222 sequenced phages listed on PhagesDB, we identified 109 distinctly small phages with genome sizes under 20,000 bp. The majority of the small phages were isolated on Arthrobacter or Microbacterium hosts. Using comparative genomics, we searched for patterns of similarity among 34 cluster-representative small phages. Dot plot comparisons showed that there was more amino acid conservation than nucleotide identity amongst small phages. Gene content similarity (GCS) analysis revealed that the temperate Gordonia phages in Cluster CW share significant GCS values (over 35%) with the lytic Arthrobacter phages in Cluster AN, suggesting that some small phages have a considerable degree of genomic similarity with each other. SplitsTree analyses of shared phams (genes with substantial amino acid identity) supported the complexity of clustering criteria in small phages, given shuffling of genes across phages of different clusters and close relationships despite varied cluster membership. We observed this continuum of phage diversity through Rhodococcus phage RRH1’s closer similarity to phages in Gordonia subcluster CW1 than CW1 is to Gordonia subcluster CW3. Finally, we were able to confirm the presence of conserved phams across not only small Gordonia phages but also within small phages from different clusters and hosts. Studying these genomic trends hidden in small phages allows us to better understand and appreciate the overall diversity of phages.

Abstract Bacteriophages (phages) exhibit high genetic diversity, and the mosaic nature of the shared genetic pool makes quantifying phage relatedness a shifting target. Early parameters for clustering of related Mycobacteria and Arthrobacter phage genomes relied on nucleotide identity thresholds but, more recently, clustering of Gordonia and Microbacterium phages has been performed according to shared gene content. Singleton phages lack the nucleotide identity and/or shared gene content required for clustering newly sequenced genomes with known phages. Whole genome metrics of novel Arthrobacter phage BlueFeather, originally designated a putative singleton, showed low nucleotide identity but high amino acid and gene content similarity with Arthrobacter phages originally assigned to Clusters FE and FI. Gene content similarity revealed that BlueFeather shared genes with these phages in excess of the parameter for clustering Gordonia and Microbacterium phages. Single gene analyses revealed evidence of horizontal gene transfer between BlueFeather and phages in unique clusters that infect a variety of bacterial hosts. Our findings highlight the advantage of using shared gene content to study seemingly genetically isolated phages and have resulted in the reclustering of BlueFeather, a putative singleton, as well as former Cluster FI phages, into a newly expanded Cluster FE.

Bacteriophages that infect Arthrobacter , a genus of bacteria which play key ecological roles in soil, warrant further study. A novel Actinobacteriophage, Giantsbane, was isolated on Arthrobacter globiformis and purified. Particle stability was tested at various temperatures and salinity concentrations by observing titer differences; unpaired Student's t-tests revealed these differences to be insignificant. Transmission electron microscopy and Illumina whole-genome sequencing revealed that Giantsbane's morphology and genome length, respectively, were characteristic of Siphoviridae phages. 94 putative open reading frames were determined using Glimmer, GeneMark, and manual review; none were associated with lysogeny. Giantsbane was placed into phage cluster AU, and SplitsTree and batch ANI analyses revealed similarities with other AU phages. The annotated genome was further analyzed using Phamerator and MEME-Suite, which identified repeated motifs present in several other phages. These findings help further our understanding of the physiological and genomic aspects of phage biology.

Abstract Bacteriophages exhibit a vast spectrum of relatedness and there is increasing evidence of close genomic relationships independent of host genus. The variability in phage similarity at the nucleotide, amino acid, and gene content levels confounds attempts at quantifying phage relatedness, especially as more novel phages are isolated. This study describes three highly similar novel Arthrobacter globiformis phages–Powerpuff, Lego, and YesChef–which were assigned to Cluster AZ using a nucleotide-based clustering parameter. Phages in Cluster AZ and Microbacterium Cluster EH, as well as the former Microbacterium singleton Zeta1847, exhibited low nucleotide similarity but gene content similarity in excess of the recently adopted Microbacterium clustering parameter, which resulted in the reassignment of Zeta1847 to Cluster EH. Additionally, Clusters AZ and EH phages encode a shared integrase indicative of a lysogenic life cycle; in the first experimental verification of a Cluster AZ phage’s life cycle, we show that phage Powerpuff is a true temperate phage and forms stable lysogens that exhibit immunity to superinfection by related phages, despite lacking identifiable repressors typically required for lysogenic maintenance and superinfection immunity. The ability of phage Powerpuff to undergo and maintain lysogeny suggests that other closely related phages encoding an integrase but lacking an identified repressor may be temperate as well. Our findings further highlight the importance of using multiple metrics to capture phage relatedness, provide additional evidence of significant shared phage genomic content spanning multiple actinobacterial host genera, and demonstrate the continued need for verification and characterization of life cycles in newly isolated phages.

Abstract Background Bacteriophages are ubiquitous, highly diverse, and relatively understudied. Growing interest in phage therapy has underscored the importance of isolating and characterizing novel bacteriophages. The Science Education Alliance-Phage Hunters Advancing Genomics and Evolutionary Science (SEA-PHAGES) program aims to address this need by involving undergraduates around the world in authentic research. Materials and Methods Nine novel mycobacteriophages - AgentM, Ajay, Aragog, Archetta, ForGetIt, Koko, Ph8s, Phlorence, and Wilkins - were isolated from soil samples in southern California using host Mycobacterium smegmatis mc2155. Each purified phage was characterized using transmission electron microscopy and genome sequencing and annotation. Results All nine bacteriophages were placed into mycobacteriophage Cluster A based on nucleotide similarity with other phages. The average genome length of all nine phages was 50,706 bp. On average, each phage had 87 total coding genes and GC content between 60-63%, consistent with that of other Cluster A phages. Transmission electron microscopy of phage particles revealed they had icosahedral heads and long, flexible tails, consistent with that of the Siphoviridae family. Plaque morphology and genome analysis confirms the nine novel phages are temperate as expected of Cluster A phages. Conclusions AgentM, Ajay, Aragog, Archetta, ForGetIt, Koko, Ph8s, Phlorence, and Wilkins are all mycobacteriophages that belong to the Siphoviridae family. Comparative genomic analyses revealed genetic mosaicism and diversity among these Cluster A phages. The discovery of these novel phages expands on the existing library of mycobacteriophage genomes.