A bstract Monocytes play an important role in the regulation of alloimmune responses after heart transplantation (HTx). Recent studies have highlighted the importance of immunometabolism in the differentiation and function of myeloid cells. While the importance of glucose metabolism in monocyte differentiation and function has been reported, a role for fatty acid β-oxidation (FAO) has not been explored. Heterotopic HTx was performed using hearts from Balb/c donor mice implanted into C57Bl/6 recipient mice and treated with etomoxir (eto), an irreversible inhibitor of carnitine palmitoyltransferase 1 (Cpt1), a rate-limiting step of FAO, or vehicle control. FAO inhibition prolonged HTx survival, reduced early T cell infiltration/ activation and reduced dendritic cell (DC) and macrophage infiltration to heart allografts of eto-treated HTx recipients. ELISPOT demonstrated eto-treated HTx were less reactive to activated donor antigen presenting cells. FAO inhibition reduced monocyte-to-DC and monocyte-to-macrophage differentiation in vitro and in vivo. Further, FAO inhibition did not alter the survival of heart allografts when transplanted into Ccr2 -deficient recipients, suggesting the effects of FAO inhibition on reduced immune cell infiltration and increased heart allograft survival were dependent on monocyte mobilization. Finally, we confirmed the importance of FAO on monocyte differentiation in vivo using conditional deletion of Cpt1a . Our findings demonstrate that targeting FAO attenuates alloimmunity after HTx, in part through impairing monocyte differentiation.

Abstract Myocardial infarction initiates cardiac remodeling and is central to heart failure pathogenesis. Following myocardial ischemia reperfusion injury, monocytes enter the heart and differentiate into diverse subpopulations of macrophages. The mechanisms and dynamics of monocyte differentiation within this context are unknown. We investigated the role of macrophage hypoxia sensing on monocyte differentiation following reperfused myocardial infarction. We show that deletion of Hif1α , a hypoxia response transcription factor, in resident cardiac macrophages led to increased remodeling and overrepresentation of a macrophage subset marked by arginase 1 ( Arg1 ) expression. Arg1 + macrophages displayed an inflammatory gene signature and were predicted to represent an intermediate state within the monocyte differentiation cascade. Lineage tracing of Arg1 + macrophages revealed the existence of a monocyte differentiation trajectory consisting of multiple transcriptionally distinct macrophage states. We further showed that deletion of Hif1α in resident cardiac macrophages resulted in arrested progression through this trajectory and accumulation of an inflammatory intermediate state marked by persistent Arg1 expression. Collectively, our findings unveil distinct trajectories of monocyte differentiation and identify hypoxia sensing as an important determinant of monocyte differentiation following myocardial infarction.

Abstract Background Cellular rejection after heart transplantation imparts significant morbidity and mortality. Current immunosuppressive strategies are imperfect, target recipient T-cells, and have a multitude of adverse effects. The innate immune response plays an essential role in the recruitment and activation of T-cells. Targeting the donor innate immune response would represent the earliest interventional opportunity within the immune response cascade. There is limited knowledge regarding donor immune cell types and functions in the setting of cardiac transplantation and no current therapeutics exist for targeting these cell populations. Methods Using genetic lineage tracing, cell ablation, and conditional gene deletion, we examined donor mononuclear phagocyte diversity and function during acute cellular rejection of transplanted hearts in mice. We performed single cell RNA sequencing on donor and recipient macrophages, dendritic cells, and monocytes at multiple timepoints after transplantation. Based on our single cell RNA sequencing data, we evaluated the functional relevance of donor CCR2 + and CCR2 - macrophages using selective cell ablation strategies in donor grafts prior to transplant. Finally, we perform functional validation of our single cell-derived hypothesis that donor macrophages signal through MYD88 to facilitate cellular rejection. Results Donor macrophages persisted in the transplanted heart and co-existed with recipient monocyte-derived macrophages. Single-cell RNA sequencing identified donor CCR2 + and CCR2 - macrophage populations and revealed remarkable diversity amongst recipient monocytes, macrophages, and dendritic cells. Temporal analysis demonstrated that donor CCR2 + and CCR2 - macrophages were transcriptionally distinct, underwent significant morphologic changes, and displayed unique activation signatures after transplantation. While selective depletion of donor CCR2 - macrophages reduced allograft survival, depletion of donor CCR2 + macrophages prolonged allograft survival. Pathway analysis revealed that donor CCR2 + macrophages were being activated through MYD88/NF-ĸβ signaling. Deletion of MYD88 in donor macrophages resulted in reduced antigen presenting cell recruitment, decreased emergence of allograft reactive T-cells, and extended allograft survival. Conclusions Distinct populations of donor and recipient macrophages co-exist within the transplanted heart. Donor CCR2 + macrophages are key mediators of allograft rejection and inhibition of MYD88 signaling in donor macrophages is sufficient to suppress rejection and extend allograft survival. This highlights the therapeutic potential of donor heart-based interventions.

Background: Allograft vasculopathy (AV) remains a major obstacle to the long-term allograft survival. While the mouse aortic transplantation model has proven a useful tool for study of the pathogenesis of AV, simultaneous transplantation of the aorta alongside the transplantation of another organ, may reveal more clinically relevant mechanisms regarding well-defined characteristics of chronic allograft rejection while reducing animal utilization. Therefore, we developed a combined heterotopic abdominal heart and aorta transplantation model in mice, which is aimed at improving our understanding of the progressive nature of AV, reduce animal and drug utilization and to further optimize the immunosuppressive strategies for its prevention. Methods: The midline of the infrarenal aorta of the recipient mouse was ligatured between the renal artery and its bifurcation. Proximal and distal aortotomy was performed at this site above and below the ligature, respectively, for the subsequent anastomoses of the donor’s aortic graft to the recipient aorta in an end-to-side fashion. The distal anastomotic site of the recipient infrarenal aorta was connected with the donor aorta. Uniquely, the proximal anastomotic site on the recipient infrarenal aorta is shared to connect both the entrance of the donor aorta and the inflow tract from the donor heart. The outflow tract from the donor heart was connected to the recipient inferior vena cava. Results: Harvest of the heart and aorta grafts takes 20-25 minutes, 10 minutes for the recipient’s preparation, 40-50 minutes for anastomoses, and overall ischemic time is within 70 minutes. The surgery survival rate was more than 96% (29/30). Both the syngeneic aorta and heart grafts survived more than 100 days in 29 recipients. Further, Balb/c to C57Bl/6 allografts treated with anti-CD40L and CTLA4.Ig survived more than 90 days. Conclusions: This new model is presented as a new tool for investigators to explore transplant immunology and assessing the immunosuppressive strategy. It is possible to share a common anastomotic stoma on the recipient’s abdominal aorta to reconstruct both the aorta graft entrance and heart graft inflow tract. This allows for investigation of allogeneic effects on both the aorta and heart from the same animal, in a single survival surgery.

Abstract Multiorgan failure is devastating, and its mechanisms and mediators are not clear. Tissue injury in one organ appears to trigger disease in remote organs. Kidney and lung are frequently affected, such as when acute kidney injury (AKI) causes acute lung injury (ALI), a frequent clinical condition with high mortality. Here we identify factors secreted from the injured kidney that cause acute lung injury. We developed a murine model mimicking the generation of respiratory failure following acute kidney injury. To identify interorgan crosstalk mediators involved, we performed scRNAseq of mouse kidneys and lungs after AKI. We then applied ligand-receptor (L-R) pairing analysis across cells residing in kidney (ligands) or lung (receptors) to identify kidney-released circulating osteopontin (OPN) as a novel mediator of AKI-induced ALI (AKI-ALI). OPN release very early after AKI largely from tubule cells triggered neutrophil and macrophage infiltration into lungs associated with endothelial leakage, interstitial edema, and functional impairment. Pharmacological or genetic inhibition of OPN prevented AKI-ALI. Transplantation of ischemic wt kidneys into wt mice caused AKI-ALI, while transplantation of ischemic OPN-global-knockout kidneys failed to induce lung endothelial leakage and AKI-ALI, identifying circulating kidney-released OPN as sufficient to cause AKI-ALI in vivo . We show that AKI in humans results in elevations in OPN levels in the serum. Increased serum OPN levels in patients with multiorgan failure have been shown to positively correlate with reduced kidney function, respiratory failure, and mortality. Thus, our results identifying OPN as a mediator of AKI-ALI may have important therapeutic implications in human AKI-ALI and multiorgan failure.

Pancreatic cancer is one of the most aggressive cancers and poses significant challenges to current therapies because of its complex immunosuppressive tumor microenvironment (TME). Oncolytic viruses armed with immunoregulatory molecules are promising strategies to overcome limited efficacy and target inaccessible and metastatic tumors. In this study, we constructed a tumor-selective vaccinia virus (VV) with deletions of the TK and A49 genes (VVLΔTKΔA49, VVL-DD) using CRISPR-Cas9-based homologous recombination. VVL-DD exhibited significant tumor selectivity in vitro and anti-tumor potency in vivo in a murine pancreatic cancer model. Then, VVL-DD was armed with an optimal combination of immunomodulatory molecules, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and interleukin-21 (IL-21), to produce VVL-GL21. VVL-GL21 induced significant tumor regression after intratumoral and systemic administration. Moreover, VVL-GL21 increased the infiltration of dendritic cells (DCs), macrophages, and T cells; induced DC maturation; increased the transition from M2 to M1 macrophages; improved the formation of immune memory; prevented tumor recurrence; and effectively bolstered the immune response against tumors in multiple key immune compartments. Interestingly, mice bearing-pancreatic cancer tumors treated with VVL-GL21 showed anti-tumor immunity against lung and colon cancer tumors. Importantly, treatment with VVL-GL21 enhanced the responsiveness of tumors to the immune checkpoint inhibitor anti-PD1. Taken together, VVL-GL21 remodels the suppressive TME and has powerful anti-tumor activities as monotherapy or in combination with anti-PD1 by intratumoral or systemic delivery for the treatment of pancreatic cancer. VVL-GL21 could be used as a therapeutic cancer vaccine.