Abstract PURPOSE To spatially map aquaporin-5 (AQP5) expression in bovine lens, molecularly characterize cytoplasmic AQP5-containing vesicles in the outer cortex, and elucidate AQP5 membrane trafficking mechanisms. METHODS Immunofluorescence was performed on bovine lens cryosections using AQP5, TOMM20, COX IV, calnexin, LC3B, LIMP-2, and connexin-50 antibodies and the fluorescent lipid membrane dye CM-DiI. AQP5 plasma membrane insertion was defined via line expression profile analysis. Transmission electron microscopy (TEM) was performed on bovine lens tissue sections to define cytoplasmic organelle identity, morphology, and subcellular localization in cortical fiber cells. Bovine lenses were treated with 10 nM bafilomycin A1 or 0.1% dimethyl sulfoxide vehicle control in ex vivo culture to determine changes in AQP5 plasma membrane expression. RESULTS Immunofluorescence analysis revealed cytoplasmic AQP5 expression in bovine lens epithelial cells and differentiating fiber cells. In the bovine lens cortex, complete AQP5 plasma membrane insertion occurs at r/a 0.951 + 0.005. AQP5-containing cytoplasmic vesicles are spheroidal, tubular in morphology, express TOMM20, and contain LC3B and LIMP-2 as fiber cells mature. TEM analysis revealed spheroidal, tubular autophagosomes, autolysosomes, and lysosomes with degrading mitochondria. AQP5-containing cytoplasmic vesicles and autolysosomes dock and fuse with the plasma membrane. Bafiloymcin A1 treatment reduced AQP5 plasma membrane expression by 27%. CONCLUSIONS AQP5 localizes to spheroidal, tubular cytoplasmic vesicles in the differentiating bovine lens fiber cells. During fiber cell differentiation, these vesicles incorporate LC3B and fuse with LIMP-2-positive lysosomes. AQP5 trafficking to the plasma membrane occurs through lysosome secretion as a novel mechanism of AQP5 trafficking.

Abstract Purpose The presence of a physical barrier to molecular diffusion through lenticular extracellular space has been repeatedly detected in multiple species. This extracellular diffusion barrier has been proposed to restrict the movement of solutes into the lens and to direct nutrients into the lens core via the sutures at both poles. The purpose of this study is to characterize the molecular components that could contribute to the formation of this barrier. Methods Three distinct regions in the bovine lens cortex were captured by laser capture microdissection guided by dye penetration. Proteins were digested by endoproteinase Lys C and trypsin. Mass spectrometry-based quantitative proteomic analysis followed by gene ontology (GO) and protein-protein interaction network analysis was performed. Results Dye penetration showed that lens fiber cells first shrink the extracellular spaces of the broad sides of fiber cells followed by closure of the extracellular space between narrow sides at normalized lens distance (r/a) of 0.9. Accompanying the closure of extracellular space of the broad sides, dramatic proteomic changes were detected including up-regulation of several cell junctional proteins. AQP0 and its interacting partners ERM proteins were among a few proteins that were upregulated accompanying the closure of extracellular space of the narrow sides suggesting a particularly important role for the major lens membrane protein AQP0 in controlling the narrowing of the extracellular spaces between lens fiber cells. The results also provided important information related to biological processes that occur during fiber cell differentiation such as organelle degradation, cytoskeletal remodeling and GSH synthesis. Conclusions The formation of lens extracellular diffusion barrier is accompanied by significant membrane and cytoskeletal protein remodeling.

Abstract The ocular lens proteome undergoes post-translational and progressive degradation as fiber cells age. The oldest fiber cells and the proteins therein are present at birth and are retained through death. Transparency of the lens is maintained in part by the high abundance crystallin family proteins (up to 300 mg/mL), which establishes a high dynamic range of protein abundance. As a result, previous Data Dependent Analysis (DDA) measurements of the lens proteome are less equipped to identify the lowest abundance proteins. In an attempt to probe more deeply into the lens proteome, we measured the insoluble lens proteome of an 18-year-old human with DDA and newer Data Independent Analysis (DIA) methods. By applying library free DIA search methods, 4,564 protein groups, 48,474 peptides and 5,577 deamidation sites were detected: significantly outperforming the quantity of identifications in using DDA and Pan-Human DIA library searches. Finally, by segmenting the lens into multiple fiber cell-age related regions, we uncovered cell-age resolved changes in proteome composition and putative function.

Abstract Hendra virus (HeV) and Nipah virus (NiV), the prototypic members of the Henipavirus (HNV) genus, are emerging, zoonotic paramyxoviruses known to cause severe disease across six mammalian orders, including humans (Eaton et al., 2006). While several research groups have made strides in developing candidate vaccines and therapeutics against henipaviruses, such countermeasures have not been licensed for human use, and significant gaps in knowledge about the human immune response to these viruses exist. To address these gaps, we isolated a large panel of human monoclonal antibodies (mAbs) from the B cells of an individual with prior occupation-related exposure to the equine HeV vaccine (Equivac® HeV). Competition-binding and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) studies identified at least six distinct antigenic sites on the HeV/NiV receptor binding protein (RBP) that are recognized by human mAbs. Antibodies recognizing multiple antigenic sites potently neutralized NiV and/or HeV isolates in vitro. The most potent class of cross-reactive antibodies achieved neutralization by blocking viral attachment to the host cell receptors ephrin-B2 and ephrin-B3. Antibodies from this class mimic receptor binding by inducing a receptor-bound conformation to the HeV-RBP protein tetramer, exposing an epitope that appears to lie hidden in the interface between protomers within the HeV-RBP tetramer. Antibodies that recognize this cryptic epitope potently neutralized HeV and NiV. Flow cytometric studies using cell-surface-displayed HeV-RBP protein showed that cross-reactive, neutralizing mAbs from each of these classes cooperate for binding. In a highly stringent hamster model of NiV B infection, antibodies from both classes reduced morbidity and mortality and achieved synergistic protection in combination and provided therapeutic benefit when combined into two bispecific platforms. These studies identified multiple candidate mAbs that might be suitable for use in a cocktail therapeutic approach to achieve synergistic antiviral potency and reduce the risk of virus escape during treatment.

Background: aCT1 is a 25 amino acid therapeutic peptide incorporating the Zonula Occludens-1 (ZO-1)-binding domain of connexin43 (Cx43) that is currently in Phase III clinical testing for healing chronic skin wounds. In preclinical studies in mice, we reported that aCT1 reduces arrhythmias and improves ventricular function following cardiac injury, effects that were accompanied by increases in PKCε phosphorylation of Cx43 at serine 368 (pS368). In this study, we undertake a systematic characterization of the molecular mode-of-action of aCT1 in mitigating the effects of ischemia reperfusion injury on ventricular contractile function. Methods and Results: To determine the basis of αCT1-mediated increases in pS368 we undertook tandem mass spectrometry of reactants in an in vitro assay of PKCε phosphorylation, identifying a potential interaction between negatively charged amino acids in the αCT1 Asp-Asp-Leu-Glu-Iso sequence and positively charged lysines (Lys345, Lys346) in a short α-helical sequence (H2) within the Cx43 CT domain. In silico modeling provided further support of the specificity of this interaction, leading us to conclude that αCT1 has potential to directly interact with both Cx43 and ZO-1. Using surface plasmon resonance, thermal shift and phosphorylation assays, we characterized a series of αCT1 variant peptides, identifying sequences competent to interact with either ZO-1 PDZ2 or the Cx43 CT, but with limited or no ability to bind both polypeptides. Based on this analysis, it was found that only those peptides competent to interact with Cx43, but not ZO-1 alone, resulted in increased pS368 phosphorylation in vitro and in vivo. Moreover, in a mouse model of global ischemia reperfusion injury we determined that pre-ischemic infusion only with those peptides competent to bind Cx43 preserved left ventricular (LV) contractile function following injury. Interestingly, a short 9 amino acid (MW=1110) Cx43-binding variant of the original 25 amino acid αCT1 sequence demonstrated potent LV protecting effects when infused either before or after ischemic injury. Conclusions: Interaction of αCT1 with the Cx43 CT, but not ZO-1 PDZ2, explains cardioprotection mediated by this therapeutic peptide. Pharmacophores targeting the Cx43 CT sequence could provide a novel translational approach to preservation of ventricular function following ischemic injury.

Glutamate cysteine ligase catalytic subunit (Gclc) is the catalytic subunit for the glutamate-cysteine ligase (Gcl) enzyme. Gcl catalyzes the rate limiting step in glutathione (GSH) synthesis. Gclc is highly expressed in the developing eye. To define the regulatory role of Gclc in eye development, we developed a novel, Le-Cre transgene-driven, Gclc knockout mouse model. Gclc f/f / Le-Cre Tg/− mice present with deformation of the retina, cornea, iris, and lens, consistent with a microphthalmia phenotype. Controlling for the microphthalmia phenotype of Gclc wt/wt / Le-Cre Tg/− mice revealed that Gclc f/f / Le-Cre Tg/− mice have a more severe microphthalmia phenotype. Thus, the loss of Gclc expression exacerbates the microphthalmia phenotype in Le-Cre mice. Gclc f/f / Le-Cre Tg/− eyes present with reduced retinal and lens epithelium proliferation and increased lens cell death. Imaging mass spectrometry of ocular tissues revealed changes in the intensity and distribution of several lipid species and proteins in the retina and corneas of Gclc f/f / Le-Cre Tg/− eyes. Lastly, using splice-blocking morpholinos and CRISPR/Cas9, we created two gclc knockdown zebrafish models, both of which display a microphthalmia phenotype. Combined, the mouse and zebrafish results indicate that, in chordates, Gclc has a conserved role in regulating eye development. In summary, these novel animal models are useful tools for elucidating the mechanisms involved in microphthalmia development.

Aquaporin-0 (AQP0) constitutes 50 % of the lens membrane proteome and plays important roles in lens fiber cell adhesion, water permeability, and lens transparency. Previous work has shown that specific proteins, such as calmodulin (CaM), interact with AQP0 to modulate its water permeability; however, these studies often used AQP0 peptides, rather than full-length protein, to probe these interactions. Furthermore, the specific regions of interaction of several known AQP0 interacting partners, i.e. αA and αB-crystallins, and phakinin (CP49) remain unknown. The purpose of this study was to use crosslinking mass spectrometry (XL-MS) to identify interacting proteins with full-length AQP0 in crude lens cortical membrane fractions and to determine the specific protein regions of interaction. Our results demonstrate, for the first time, that the AQP0 N-terminus can engage in protein interactions. Specific regions of interaction are elucidated for several AQP0 interacting partners including phakinin, α-crystallin, connexin-46, and connexin-50. In addition, two new interacting partners, vimentin and connexin-46, were identified.

The human retina evolved to facilitate complex visual tasks. It supports vision at light levels ranging from starlight to sunlight, and its supporting tissues and vasculature regulate plasma-delivered lipophilic essentials for vision, including retinoids (vitamin A derivatives). The human retina is of particular interest because of its unique anatomic specializations for high-acuity and color vision that are also vulnerable to prevalent blinding diseases. The retina's exquisite cellular architecture is composed of numerous cell types that are aligned horizontally, giving rise to structurally distinct cell, synaptic, and vascular layers that are visible in histology and in diagnostic clinical imaging. Suitable for retinal investigations, MALDI imaging mass spectrometry (IMS) technologies are now capable of providing images at low micrometer spatial resolution with high levels of chemical specificity. In this study, a multimodal imaging approach combined with a recently developed method of high accuracy multi-image registration was used to define the localization of lipids in human retina tissue at laminar, cellular, and sub-cellular levels. Data acquired by IMS combined with autofluorescence and bright-field microscopy of human retina sections in macular and peripheral regions indicate differences in distributions and abundances of lipid species across and within single cell types. Of note is localization of signals within specific layers of macula, localization within different compartments of photoreceptors and RPE, complementarity of signals between macular retina and non-macular RPE, and evidence that lipids differing by a single double bond can have markedly different distributions.### Competing Interest Statement

Abstract The eye lens is responsible for focusing and transmitting light to the retina. The lens does this in the absence of organelles yet maintains transparency for at least five decades before onset of age-related nuclear cataract (ARNC). It is hypothesized that oxidative stress contributes significantly to ARNC formation. It is additionally hypothesized that transparency is maintained by a microcirculation system (MCS) that delivers antioxidants to the lens nucleus and exports small molecule waste. Common data-ependent acquisition (DDA) methods are hindered by dynamic range of lens protein expression and provide limited context to age-related changes in the lens. In this study we utilized data-independent acquisition (DIA) mass spectrometry to analyze the urea insoluble, membrane protein fractions of 16 human lenses subdivided into three spatially distinct lens regions to characterize age-related changes, particularly concerning the lens MCS and oxidative stress response. In this pilot cohort, we measured 4,788 distinct protein groups, 46,681 peptides, and 7,592 deamidated sequences, more than in any previous human lens DDA approach. Our results reveal age-related changes previously known in lens biology and expand on these findings, taking advantage of the rich dataset afforded by DIA. Principally, we demonstrate that a significant proteome remodeling event occurs at approximately 50 years of age, resulting in metabolic preference for anaerobic glycolysis established with organelle degradation, decreased abundance of protein networks involved in calcium-dependent cell-cell contacts while retaining networks related to oxidative stress response. Further, we identified multiple antioxidant transporter proteins not previously detected in the human lens and describe their spatiotemporal and age-related abundance changes. Finally, we demonstrate that aquaporin-5, among other proteins, is modified with age by PTMs including deamidation and truncation. We suggest that the continued accumulation of each of these age-related outcomes in proteome remodeling contribute to decreased fiber cell permeability and result in ARNC formation.