Enterovirus 71 (EV71) is a major agent of hand, foot and mouth disease in children that can cause severe central nervous system disease and death. No vaccine or antiviral therapy is available. High-resolution structural analysis of the mature virus and natural empty particles shows that the mature virus is structurally similar to other enteroviruses. In contrast, the empty particles are markedly expanded and resemble elusive enterovirus-uncoating intermediates not previously characterized in atomic detail. Hydrophobic pockets in the EV71 capsid are collapsed in this expanded particle, providing a detailed explanation of the mechanism for receptor-binding triggered virus uncoating. These structures provide a model for enterovirus uncoating in which the VP1 GH loop acts as an adaptor-sensor for cellular receptor attachment, converting heterologous inputs to a generic uncoating mechanism, highlighting new opportunities for therapeutic intervention.

Radiation damage to cryocooled protein crystals during x-ray structure determination has become an inherent part of macromolecular diffraction data collection at third-generation synchrotrons. Generally, radiation damage is an undesirable component of the experiment and can result in erroneous structural detail in the final model. The characterization of radiation damage thus has become an important area for structural biologists. The calculated dose limit of 2 × 10 7 Gy for the diffracting power of cryocooled protein crystals to drop by half has been experimentally evaluated at a third-generation synchrotron source. Successive data sets were collected from four holoferritin and three apoferritin crystals. The absorbed dose for each crystal was calculated by using the program raddose after measurement of the incident photon flux and determination of the elemental crystal composition by micro-particle-induced x-ray emission. Degradation in diffraction quality and specific structural changes induced by synchrotron radiation then could be compared directly with absorbed dose for different dose/dose rate regimes: a 10% lifetime decrease for a 10-fold dose rate increase was observed. Remarkable agreement both between different crystals of the same type and between apoferritin and holoferritin was observed for the dose required to reduce the diffracted intensity by half ( D 1/2 ). From these measurements, a dose limit of D 1/2 = 4.3 (±0.3) ×10 7 Gy was obtained. However, by considering other data quality indicators, an intensity reduction to I ln2 = ln2 × I 0 , corresponding to an absorbed dose of 3.0 × 10 7 Gy, is recommended as an appropriate dose limit for typical macromolecular crystallography experiments.

The availability of intense microbeam macromolecular crystallography beamlines at third-generation synchrotron sources has enabled data collection and structure solution from microcrystals of <10 µm in size. The increased likelihood of severe radiation damage where microcrystals or particularly sensitive crystals are used forces crystallographers to acquire large numbers of data sets from many crystals of the same protein structure. The associated analysis and merging of multi-crystal data is currently a manual and time-consuming step. Here, a computer program, BLEND, that has been written to assist with and automate many of the steps in this process is described. It is demonstrated how BLEND has successfully been used in the solution of a novel membrane protein.

Abstract In macromolecular crystallography radiation damage limits the amount of data that can be collected from a single crystal. It is often necessary to merge data sets from multiple crystals, for example small-wedge data collections on micro-crystals, in situ room-temperature data collections, and collection from membrane proteins in lipidic mesophase. Whilst indexing and integration of individual data sets may be relatively straightforward with existing software, merging multiple data sets from small wedges presents new challenges. Identification of a consensus symmetry can be problematic, particularly in the presence of a potential indexing ambiguity. Furthermore, the presence of non-isomorphous or poor-quality data sets may reduce the overall quality of the final merged data set. To facilitate and help optimise the scaling and merging of multiple data sets, we developed a new program, xia2.multiplex , which takes data sets individually integrated with DIALS and performs symmetry analysis, scaling and merging of multicrystal data sets. xia2.multiplex also performs analysis of various pathologies that typically affect multi-crystal data sets, including non-isomorphism, radiation damage and preferential orientation. After describing a number of use cases, we demonstrate the benefit of xia2.multiplex within a wider autoprocessing framework in facilitating a multi-crystal experiment collected as part of in situ room-temperature fragment screening experiments on the SARS-CoV-2 main protease.

1 Abstract Human gamma-D crystallin (HGD) is the major constituent of the eye lens. Aggregation of HGD contributes to cataract formation, the leading cause of blindness worldwide. It is unique in its longevity, maintaining its folded and soluble state for 50-60 years. One outstanding question is the structural basis of this longevity despite oxidative aging and environmental stressors including ultraviolet radiation (UV). Here we present crystallographic structures evidencing a UV-induced crystallin redox switch mechanism. The room-temperature serial synchrotron crystallographic (SSX) structure of freshly prepared crystallin shows no post-translational modifications. After aging for nine months in the absence of light, a covalently bound reducing agent modifying surface cysteines is observed for the first time by low-dose SSX. This is shown to be UV-labile in an acutely light-exposed structure. This suggests a mechanism by which a major source of crystallin damage, UV, may also act as a rescuing factor in a finely balanced redox system.

Abstract X-ray induced radiation damage is a limiting factor for the macromolecular crystallographer and data must often be merged from many crystals to yield complete datasets for structure solution of challenging samples. Increasing the X-ray energy beyond the typical 10-15 keV range promises to provide an extension of crystal lifetime via an increase in diffraction efficiency. To date however hardware limitations have negated any possible gains. Through the first use of a Cadmium Telluride Eiger2 detector and a beamline optimised for high energy data collection, we show that at higher energies fewer crystals will be required to obtain complete data, as the diffracted intensity per unit dose increases by a factor of more than 3 between 12.4 and 25 keV. Additionally, those higher energy data provide more information, evidenced by an increase in high-resolution limit of up to 0.3 Å, pointing to a high energy future for synchrotron-based macromolecular crystallography.

Protein–inhibitor crystal structures aid medicinal chemists in efficiently improving the potency and selectivity of small-molecule inhibitors. It is estimated that a quarter of lead molecules in drug discovery projects are halogenated. Protein–inhibitor crystal structures have shed light on the role of halogen atoms in ligand binding. They form halogen bonds with protein atoms and improve shape complementarity of inhibitors with protein binding sites. However, specific radiation damage (SRD) can cause cleavage of carbon–halogen (C– X ) bonds during X-ray diffraction data collection. This study shows significant C– X bond cleavage in protein–ligand structures of the therapeutic cancer targets B-cell lymphoma 6 (BCL6) and heat shock protein 72 (HSP72) complexed with halogenated ligands, which is dependent on the type of halogen and chemical structure of the ligand. The study found that metrics used to evaluate the fit of the ligand to the electron density deteriorated with increasing X-ray dose, and that SRD eliminated the anomalous signal from brominated ligands. A point of diminishing returns is identified, where collecting highly redundant data reduces the anomalous signal that may be used to identify binding sites of low-affinity ligands or for experimental phasing. Straightforward steps are proposed to mitigate the effects of C– X bond cleavage on structures of proteins bound to halogenated ligands and to improve the success of anomalous scattering experiments.

Abstract The marine cyanobacterium Prochlorococcus is a main contributor to global photosynthesis, whilst being limited by iron availability. Cyanobacterial genomes typically encode two different types of FutA iron binding proteins: periplasmic FutA2 ABC transporter subunits bind Fe(III), while cytosolic FutA1 binds Fe(II). Owing to their small size and their economized genome Prochlorococcus ecotypes typically possess a single futA gene. How the encoded FutA protein might bind different Fe oxidation states was previously unknown. Here we use structural biology techniques at room temperature to probe the dynamic behavior of FutA. Neutron diffraction confirmed four negatively charged tyrosinates, that together with a neutral water molecule coordinate iron in trigonal bipyramidal geometry. Positioning of the positively charged Arg103 side chain in the second coordination shell yields an overall charge-neutral Fe(III) binding state in structures determined by neutron diffraction and serial femtosecond crystallography. Conventional rotation X-ray crystallography using a home source revealed X-ray induced photoreduction of the iron center with observation of the Fe(II) binding state; here, an additional positioning of the Arg203 side chain in the second coordination shell maintained an overall charge neutral Fe(II) binding site. Dose series using serial synchrotron crystallography and an XFEL X-ray pump-probe approach capture the transition between Fe(III) and Fe(II) states, revealing how Arg203 operates as a switch to accommodate the different iron oxidation states. This switching ability of the Prochlorococcus FutA protein may reflect ecological adaptation by genome streamlining and loss of specialized FutA proteins. Significance Statement Oceanic primary production by marine cyanobacteria is a main contributor to carbon and nitrogen fixation. Prochlorococcus is the most abundant photosynthetic organism on Earth, with an annual carbon fixation comparable to the net global primary production from agriculture. Its remarkable ecological success is based on the ability to thrive in low nutrient waters. To manage iron limitation, Prochlorococcus possesses the FutA protein for iron uptake and homeostasis. We reveal a molecular switch in the FutA protein that allows it to accommodate binding of iron in either the Fe(III) or Fe(II) state using structural biology techniques at room temperature and provide a plausible mechanism for iron binding promiscuity.

Temperature control is a key aspect of macromolecular crystallography, with the technique of cryocooling routinely used to mitigate X-ray induced damage. Beam induced heating could cause the temperature of crystals to rise above the glass transition temperature, greatly increasing the rate of damage. X-ray induced heating of ruby crystals 20-40 microns in size has been quantified non-invasively by monitoring the emission wavelengths of X-ray induced fluorescence during exposure to the X-ray beam. For beamsizes and dose-rates typically used in macromolecular crystallography the temperature rises are of order 20 K. The temperature changes observed are compared with models in the literature and can be used as a validation tool for future models.

Copper nitrite reductases (CuNiRs) exhibit a strong pH dependence of their catalytic activity. Structural movies can be obtained by serially recording multiple structures (frames) from the same spot of a crystal using the MSOX serial crystallography approach. This method has been combined with on-line single crystal optical spectroscopy to capture the pH-dependent structural changes that accompany during turnover of CuNiRs from two Rhizobia species. The structural movies, initiated by the redox activation of a type-1 copper site (T1Cu) via X-ray generated photoelectrons, have been obtained for the substrate-free and substrate-bound states at low (high enzymatic activity) and high (low enzymatic activity) pH. At low pH, formation of the product nitric oxide (NO) is complete at the catalytic type-2 copper site (T2Cu) after a dose of 3 MGy (frame 5) with full bleaching of the T1Cu ligand-to-metal charge transfer (LMCT) 455 nm band (S(σ)Cys → T1Cu2+) which in itself indicates the electronic route of proton-coupled electron transfer (PCET) from T1Cu to T2Cu. In contrast at high pH, the changes in optical spectra are relatively small and the formation of NO is only observed in later frames (frame 15 in Br2DNiR, 10 MGy), consistent with the loss of PCET required for catalysis. This is accompanied by decarboxylation of the catalytic AspCAT residue, with CO2 trapped in the catalytic pocket.