Abstract Identifying tumor suppressor genes is predicted to inform on the development of novel strategies for cancer therapy. To identify new tumor driving processes we have used a genome-wide CRISPR/Cas9 knockout screen in Eµ-Myc;Cas9 transgenic hematopoietic stem and progenitor cells in vivo . We uncovered that loss of either of the GATOR1 complex components - NPRL3, DEPDC5, NPRL2 - significantly accelerated c-MYC-driven lymphoma development in mice, indeed to an extent comparable to loss of p53. In human lymphomas mutations or low expression of the GATOR1 complex genes were mutually exclusive with defects in p53 and correlated with poor survival outcomes for patients with high MYC-expressing cancers. Lymphomas lacking GATOR1 were highly sensitive to mTOR inhibitors, both in vitro and in vivo . These findings identify inhibition of mTORC1 as a potent tumor suppressive mechanism in c-MYC-driven lymphomagenesis, and suggest a new avenue for therapeutic intervention in GATOR1-deficient lymphomas through mTOR inhibition. Statement of Significance Our in vivo CRISPR/Cas9 whole genome knockout screens identified the GATOR1 complex as a potent suppressor in c-MYC-driven lymphomagenesis. GATOR1 deficiency obviates the pressure to lose p53 during c-MYC driven lymphoma development and primes these malignant cells for heightened sensitivity to mTOR inhibition, suggesting a novel therapeutic approach.

The tumour suppressor TP53 is the most frequently mutated gene in human cancer and these aberrations confer poor chemotherapeutic responses. Point mutations typically cluster in the DNA binding domain, with certain hot-spot residues disproportionally represented. These mutations abrogate binding of the TP53 transcription factor to DNA and thereby prevent upregulation of genes critical for tumour suppression (loss-of-function). Mutant TP53 is reported to additionally contribute to tumour development, sustained growth and metastasis not only through dominant-negative effects on wild-type TP535 but also through neomorphic gain-of-function (GOF) activities. Understanding the contributions of these postulated attributes of mutant TP53 to the development and expansion of tumours will facilitate the design of rational therapeutic strategies. Here we used CRISPR/CAS9 to delete mutant TP53 in a panel of diverse human cancer cell lines. The loss of mutant TP53 expression had no impact on the survival, proliferative capacity or metabolic state of the tumour cells, nor did it sensitise them to cellular stresses and chemotherapeutic agents. These data suggest that putative GOF effects of mutant TP53 are not universally required for the sustained survival and proliferation of fully malignant cells. Therefore, therapeutic approaches that abrogate expression or function of mutant TP53 would not be expected to have substantial impact.

Abstract Cas12a is a gene-editing tool that simplifies multiplexed gene targeting through its RNase activity, enabling maturation of individual crRNAs from a pre-crRNA-encoding RNA. Here, we present a mouse model that constitutively expresses enhanced Acidaminococcus sp. Cas12a ( enAsCas12a ) linked to an mCherry fluorescent reporter. We demonstrate efficient single and multiplexed gene-editing in cells from enAsCas12a KI mice. To test in vivo activity, we transduced haematopoietic stem cells from E μ -Myc T/+ ;enAsCas12a KI/+ animals with Trp53 -targeting pre-crRNAs followed by transplantation into irradiated recipient animals. Tumour development was accelerated and TRP53 protein lost. We generated compact, genome-wide Cas12a knockout libraries targeting each gene with four guide RNAs encoded on two (Menuetto) or one (Scherzo) vector. Introducing these libraries into E μ -Myc T/+ ;enAsCas12a KI/+ lymphoma cells followed by treatment with an MCL-1 inhibitor (S63845) or TRP53-inducer (nutlin-3a) identified known and novel drug resistance genes. Finally, we demonstrate simultaneous gene knockouts ( Trp53 or combined Bax/Bak ) and activation ( Cd19 ) in primary T cells and mouse dermal fibroblasts from crosses of our enAsCas12a and CRISPR activation models ( dCas9a-SAM ). Our enAsCas12a mouse model and accompanying libraries enhance genome engineering capabilities and complements current CRISPR technologies.

Abstract The RAS oncogene and upregulation of the RAS signalling pathway is highly prevalent in human cancer, and therefore, therapeutically targeting the RAS pathway is a common treatment in cancer. However, RAS pathway upregulation is not sufficient to drive malignant cancer, since senescence mechanisms prevent cancer progression. Thus, additional mutations, such as mutations that prevent senescence or alter the tissue architecture (cell polarity), are required for RAS -driven tumour progression. Moreover, targeting RAS -driven cancers with RAS pathway inhibitors can often lead to undesirable side-effects and to drug resistance. Thus, identifying compounds that synergise with RAS-pathway inhibitors would enable lower doses of the RAS pathway inhibitors to be used and also decrease the acquisition of drug resistance. Here, in a boutique chemical screen using a Drosophila model of Ras-driven cell polarity-impaired cancer, we have identified compounds that reduce tumour burden by synergising with subtherapeutic doses of the RAS pathway inhibitor, Trametinib, which inhibits mitogen-activated kinase kinase (MEK). Analysis of one of the hits from the screen, Ritanserin, which targets serotonin receptors and diacy glycerol kinase alpha (DGK α ), revealed that DGK α was the critical target in its synergism with Trametinib. We show that human mammary epithelial cells harbouring the H-RAS oncogene and knockdown of the cell polarity gene, SCRIB , are also sensitive to treatment with low doses of Trametinib and DGK α inhibition. Mechanistically, DGK α inhibition synergises with Trametinib by inhibiting MEK and mTOR activity. Altogether, our results provide evidence that targeting RAS-driven human cancers with RAS pathway and DGK α inhibitors will be an effective combination therapy.

CRISPR activation (CRISPRa) co-opts nuclease-dead Cas-molecule DNA-binding capabilities to direct transcriptional activators to specific loci, driving gene expression. CRISPRa technology has advanced rapidly in the past few years, and it is now applicable to a wide range of biological questions, including the study of cancer. In this review, we discuss the different forms of CRISPRa technologies, their in vitro and in vivo applications, and recent studies that have used CRISPRa in their cancers of choice in highly diverse studies. We further discuss the different CRISPRa tools that are available, including mouse models and single-guide RNA libraries. Finally, we examine the maturation of CRISPRa, as its potential therapeutic applications are beginning to be explored.