ABSTRACT Hsp40s, also termed J-domain proteins, play a central role in cellular protein homeostasis by promiscuously surveying the proteome for misfolded proteins. We have exploited this property to develop Hsp40 affinity profiling as a method for identifying proteins that misfold in response to cellular stresses. In this assay, we use the Hsp40 Flag DNAJB8 H31Q as our recognition element for misfolded proteins. This protein is exogenously introduced into cells, promoting interactions without regard for native protein clients. Herein, we evaluate potential approaches to improve the performance of this assay. We find that although intracellular crosslinking increases recovery of protein interactors, this is not enough to overcome the relative drop in DNAJB8 recovery. While the J-domain promotes Hsp70 association, it does not affect the yield of protein association with DNJAB8 under basal conditions. By contrast, crosslinking and J-domain ablation both substantially increase relative protein interactor recovery with the structurally distinct Class B Hps40 DNAJB1 but are completely compensated by poorer yield of DNAJB1 itself. Cellular thermal stress promotes increased affinity between DNAJB8 H31Q and interacting proteins, as expected for interactions driven by recognition of misfolded proteins. DNAJB8 WT does not demonstrate such a property, suggesting that under stress misfolded proteins are handed off to Hsp70. Hence, we find that DNAJB8 H31Q is still our most effective recognition element for the recovery of destabilized client proteins following cellular stress. Raw data is accessible through the PRIDE Archive at PXD030633.

Abstract Voltage-gated ion channels (VGICs) comprise multiple structural units whose assembly is required for function 1,2 . There is scant structural understanding of how VGIC subunits assemble and whether chaperone proteins are required. High-voltage activated calcium channels (Ca V s) 3,4 are paradigmatic multi-subunit VGICs from electrically excitable tissues whose function and trafficking is powerfully shaped by interactions between pore-forming Ca V 1 or Ca V 2 Ca V α 1 3 and auxiliary Ca V β 5 , and Ca V α 2 δ subunits 6,7 . Here, we present cryo-EM structures of human brain and cardiac Ca V 1.2 bound with Ca V β 3 to a chaperone, the endoplasmic reticulum membrane protein complex (EMC) 8,9 , and of the isolated Ca V 1.2/Ca V β 3 /Ca V α 2 δ-1 channel. These provide an unprecedented view of an EMC holdase:client complex and define EMC sites, the TM and Cyto docks, whose interaction with the client channel cause partial extraction of a pore subunit and splay open the Ca V α 2 δ interaction site. The structures further identify the Ca V α 2 δ binding site for gabapentinoid anti-pain and anti-anxiety drugs 6 , show that EMC and Ca V α 2 δ channel interactions are mutually exclusive, and indicate that EMC to Ca V α 2 δ handoff involves a Ca 2+ -dependent step and ordering of multiple Ca V 1.2 elements. Together, the structures unveil a Ca V assembly intermediate and previously unknown EMC client binding sites that have broad implications for biogenesis of VGICs and other membrane proteins.

Acyl-CoA/protein interactions are required for many functions essential to life including membrane synthesis, oxidative metabolism, and macromolecular acetylation. However, despite their importance, the global scope and selectivity of these protein-metabolite interactions remains undefined. Here we describe the development of CATNIP (CoA/AcetylTraNsferase Interaction Profiling), a chemoproteomic platform for the high-throughput analysis of acyl-CoA/protein interactions in endogenous proteomes. First, we apply CATNIP to identify acetyl-CoA-binding proteins through unbiased clustering of competitive dose-response data. Next, we use this method to profile diverse protein-CoA metabolite interactions, identifying biological processes susceptible to altered acetyl-CoA levels. Finally, we apply systems-level analyses to assess the features of novel protein networks that may interact with acyl-CoAs, and demonstrate a strategy for high-confidence proteomic annotation of acetyl-CoA binding proteins. Overall our studies illustrate the power of integrating chemoproteomics and systems biology, and provide a resource for understanding the roles of acyl-CoA metabolites in biology and disease.

Abstract Chemical proteomics provides a powerful strategy for the high-throughput assignment of enzyme function or inhibitor selectivity. However, identifying optimized probes for an enzyme family member of interest and differentiating signal from background remain persistent challenges in the field. To address this obstacle, here we report a physiochemical discernment strategy for optimizing chemical proteomics based on the Coenzyme A (CoA) cofactor. First, we synthesize a pair of CoA-based Sepharose pulldown resins differentiated by a single negatively charged residue, and find this change alters their capture properties in gel-based profiling experiments. Next, we integrate these probes with quantitative proteomics and benchmark analysis of ‘probe selectivity’ versus traditional ‘competitive chemical proteomics’. This reveals the former is well-suited for the identification of optimized pulldown probes for specific enzyme family members, while the latter may have advantages in discovery applications. Finally, we apply our anionic CoA pulldown probe to evaluate the selectivity of a recently reported small molecule N-terminal acetyltransferase inhibitor. These studies further validate the use of physical discriminant strategies in chemoproteomic hit identification and demonstrate how CoA-based chemoproteomic probes can be used to evaluate the selectivity of small molecule protein acetyltransferase inhibitors, an emerging class of pre-clinical therapeutic agents.

The identification and quantification of misfolded proteins from complex mixtures is important for biological characterization and disease diagnosis, but remains a major bioanalytical challenge. We have developed Hsp40 Affinity Profiling as a bioanalytical approach to profile protein stability in response to cellular stress. In this assay, we ectopically introduce the Hsp40