The blood-brain barrier (BBB) provides a constant homeostatic brain environment that is essential for proper neural function. An unusually low rate of vesicular transport (transcytosis) has been identified as one of the two unique properties of CNS endothelial cells, relative to peripheral endothelial cells, that maintain the restrictive quality of the BBB. However, it is not known how this low rate of transcytosis is achieved. Here we provide a mechanism whereby the regulation of CNS endothelial cell lipid composition specifically inhibits the caveolae-mediated transcytotic route readily used in the periphery. An unbiased lipidomic analysis reveals significant differences in endothelial cell lipid signatures from the CNS and periphery, which underlie a suppression of caveolae vesicle formation and trafficking in brain endothelial cells. Furthermore, lipids transported by Mfsd2a establish a unique lipid environment that inhibits caveolae vesicle formation in CNS endothelial cells to suppress transcytosis and ensure BBB integrity.

Abstract Tight junctions (TJs) between blood-brain barrier (BBB) endothelial cells construct a robust physical barrier, whose damage underlies BBB dysfunctions related to several neurodegenerative diseases. What makes these highly specialized BBB-TJs extremely restrictive remains unknown. Here, we use super-resolution microscopy (dSTORM) to uncover new structural and functional properties of BBB TJs. Focusing on three major components, Nano-scale resolution revealed sparse (occludin) vs. clustered (ZO1/claudin-5) molecular architecture. Developmentally, permeable TJs become first restrictive to large molecules, and only later to small molecules, with claudin-5 proteins arrangement compacting during this maturation process. Mechanistically, we reveal that ZO1 clustering is independent of claudin-5 in-vivo . In contrast to accepted knowledge, we found that in the developmental context, total levels of claudin-5 inversely correlate with TJ functionality. Our super-resolution studies provide a unique perspective of BBB TJs and open new directions for understanding TJ functionality in biological barriers, ultimately enabling restoration in disease or modulation for drug delivery.

Abstract The Balbiani body (Bb) is a membraneless organelle that forms in oocytes from insects to humans. In most vertebrates the Bb contains essential RNA-protein (RNP) granules, establishes oocyte polarity, and is required embryogenesis and reproduction. In mammals the Bb is associated with primordial follicle formation. However, despite its discovery in 1845, the mechanisms of Bb formation are still unknown in any species. Here, we discovered mechanisms of Bb formation in zebrafish. We first provide three lines of live-imaging, molecular, and biochemical evidence in developing ovaries in-vivo to conclude that the Bb forms a molecular condensate. We show that Bb RNPs form insoluble complexes dependently on Buc, an intrinsically disordered protein with a functional prion-like domain, which is essential for Bb formation. By using in vivo live-imaging, FRAP experiments and genetics, we reveal that Bb condensation requires the early liquid-liquid phase-transition of Buc, which later progresses to liquid-solid phase-separation. Further, we uncovered multi-step regulation by microtubules in controlling Bb condensation: first, by direct dynein-mediated trafficking of early condensing Buc granules, then by scaffolding condensed granules likely via molecular crowding, and finally by caging the mature Bb to prevent its over-growth and coarsening, likely by a Pickering effect. These regulatory steps ensure the formation of a single Bb condensate, which is essential for oocyte polarization and development. Our work resolves the origins of embryonic polarity, and identifies molecular condensation as an overlooked phenomena in the developing vertebrate ovary. While phase-separation is often viewed as a self-assembly process, our work proposes a new paradigm for the regulation of molecular condensation widely in biology.

Abstract CNS vasculature differs from vascular networks of peripheral organs by its ability to tightly control selective material exchange across capillary barriers. Capillary permeability is mostly defined by unique cellular components of the endothelium. While capillaries are extensively investigated, the barrier properties of larger vessels are understudied. Here, we investigate barrier properties of CNS arterial walls. Using tracer challenges and various imaging modalities, we discovered that at the mouse cortex, the arterial barrier does not reside at the classical level of the endothelium. The arterial wall’s unique permeability acts bi-directionally; CSF substances travel along the glymphatic path and can penetrate from the peri-vascular space through arteriolar walls towards the lumen. We found that caveolae vesicles in arteriole endothelial and smooth-muscle cells are functional transcytosis machinery components, and that a similar mechanism is evident in the human brain. Our discoveries highlight vascular heterogeneity investigations as a potent approach to uncover new barrier mechanisms.

Abstract Background and aims Mitral Valve Prolapse (MVP) is a common valvular disorder associated with significant morbidity and mortality, with a strong genetic basis. This study aimed to identify a mutation in a family with MVP and to characterize the valve phenotype in LTBP2 knockout mice. Methods Exome sequencing and segregation analysis were performed on a large family with MVP. Two mouse strains were generated: a complete knockout (KO) of the LTBP2 gene and a knock-in (KI) of the human mutation. At 6 months, phenotyping was conducted using echocardiography, histology, eye optical coherence tomography, and qPCR analysis for TGFβ signaling targets (periostin/POSTN, RUNX2, and CTGF) in valve tissues. Results LTBP2 rs117800773 V1506M mutation exhibited segregation with MVP. LTBP2 KO mice had higher incidence of myxomatous changes by histology (7 of 9 of KO vs. 0 of 7 control animals, p=0.00186) and echocardiography (7 of 9 vs. 0 of 8, p=0.0011). LTBP2 Knock-in mice for the human mutation showed a significantly elevated myxomatous histological phenotype (8 of 8 vs. 0 of 9, p=0.00004) as well as by echocardiography (6 of 8 vs. 0 of 9, p=0.00123). KO mice demonstrated an increase in the depth of the anterior chamber as well as reduced visual acuity. LTBP2 KO mice demonstrated overexpression of both TGFβ signaling targets RUNX2 and periostin (P=0.0144 and P=0.001826, respectively). Conclusions We report a knockout mouse strain with an LTBP2 mutation, demonstrating a valve phenotype, alongside a family with a novel mutation linked to MVP

Highlights•The Balbiani forms in oogenesis by developmental molecular condensation of Buc•Bb evolves from dynamic, liquid-like Buc granules to a solid, stable compartment•Multistep regulation by microtubules controls Buc condensation, ensuring polarity•Novel candidate Buc regulators, partners, and targets are identifiedSummaryVertebrate oocyte polarity has been observed for two centuries and is essential for embryonic axis formation and germline specification, yet its underlying mechanisms remain unknown. In oocyte polarization, critical RNA-protein (RNP) granules delivered to the oocyte's vegetal pole are stored by the Balbiani body (Bb), a membraneless organelle conserved across species from insects to humans. However, the mechanisms of Bb formation are still unclear. Here, we elucidate mechanisms of Bb formation in zebrafish through developmental biomolecular condensation. Using super-resolution microscopy, live imaging, biochemical, and genetic analyses in vivo, we demonstrate that Bb formation is driven by molecular condensation through phase separation of the essential intrinsically disordered protein Bucky ball (Buc). Live imaging, molecular analyses, and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments in vivo reveal Buc-dependent changes in the Bb condensate's dynamics and apparent material properties, transitioning from liquid-like condensates to a solid-like stable compartment. Furthermore, we identify a multistep regulation by microtubules that controls Bb condensation: first through dynein-mediated trafficking of early condensing Buc granules, then by scaffolding condensed granules, likely through molecular crowding, and finally by caging the mature Bb to prevent overgrowth and maintain shape. These regulatory steps ensure the formation of a single intact Bb, which is considered essential for oocyte polarization and embryonic development. Our work offers insight into the long-standing question of the origins of embryonic polarity in non-mammalian vertebrates, supports a paradigm of cellular control over molecular condensation by microtubules, and highlights biomolecular condensation as a key process in female reproduction.Graphical abstract