Most plant microRNAs (miRNAs) have perfect or near-perfect complementarity with their targets. This is consistent with their primary mode of action being cleavage of target mRNAs, similar to that induced by perfectly complementary small interfering RNAs (siRNAs). However, there are natural targets with up to five mismatches. Furthermore, artificial siRNAs can have substantial effects on so-called off-targets, to which they have only limited complementarity. By analyzing the transcriptome of plants overexpressing different miRNAs, we have deduced a set of empirical parameters for target recognition. Compared to artificial siRNAs, authentic plant miRNAs appear to have much higher specificity, which may reflect their coevolution with the remainder of the transcriptome. We also demonstrate that miR172, previously thought to act primarily by translational repression, can efficiently guide mRNA cleavage, although the effects on steady-state levels of target transcripts are obscured by strong feedback regulation. This finding unifies the view of plant miRNA action.

Considerable progress has been made in identifying the targets of plant microRNAs, many of which regulate the stability or translation of mRNAs that encode transcription factors involved in development. In most cases, it is unknown, however, which immediate transcriptional targets mediate downstream effects of the microRNA-regulated transcription factors. We identified a new process controlled by the miR319-regulated clade of TCP (TEOSINTE BRANCHED/CYCLOIDEA/PCF) transcription factor genes. In contrast to other miRNA targets, several of which modulate hormone responses, TCPs control biosynthesis of the hormone jasmonic acid. Furthermore, we demonstrate a previously unrecognized effect of TCPs on leaf senescence, a process in which jasmonic acid has been proposed to be a critical regulator. We propose that miR319-controlled TCP transcription factors coordinate two sequential processes in leaf development: leaf growth, which they negatively regulate, and leaf senescence, which they positively regulate.

Cell proliferation is an important determinant of plant form, but little is known about how developmental programs control cell division. Here, we describe the role of microRNA miR396 in the coordination of cell proliferation in Arabidopsis leaves. In leaf primordia, miR396 is expressed at low levels that steadily increase during organ development. We found that miR396 antagonizes the expression pattern of its targets, the GROWTH-REGULATING FACTOR (GRF) transcription factors. miR396 accumulates preferentially in the distal part of young developing leaves, restricting the expression of GRF2 to the proximal part of the organ. This, in turn, coincides with the activity of the cell proliferation marker CYCLINB1;1. We show that miR396 attenuates cell proliferation in developing leaves, through the repression of GRF activity and a decrease in the expression of cell cycle genes. We observed that the balance between miR396 and the GRFs controls the final number of cells in leaves. Furthermore, overexpression of miR396 in a mutant lacking GRF-INTERACTING FACTOR 1 severely compromises the shoot meristem. We found that miR396 is expressed at low levels throughout the meristem, overlapping with the expression of its target, GRF2. In addition, we show that miR396 can regulate cell proliferation and the size of the meristem. Arabidopsis plants with an increased activity of the transcription factor TCP4, which reduces cell proliferation in leaves, have higher miR396 and lower GRF levels. These results implicate miR396 as a significant module in the regulation of cell proliferation in plants.

Summary

 Many microRNAs (miRNAs) are encoded by small gene families. In a third of all conserved Arabidopsis miRNA families, members vary at two or more nucleotide positions. We have focused on the related miR159 and miR319 families, which share sequence identity at 17 of 21 nucleotides, yet affect different developmental processes through distinct targets. MiR159 regulates MYB mRNAs, while miR319 predominantly acts on TCP mRNAs. In the case of miR319, MYB targeting plays at most a minor role because miR319 expression levels and domain limit its ability to affect MYB mRNAs. In contrast, in the case of miR159, the miRNA sequence prevents effective TCP targeting. We complement these observations by identifying nucleotide positions relevant for miRNA activity with mutants recovered from a suppressor screen. Together, our findings reveal that functional specialization of miR159 and miR319 is achieved through both expression and sequence differences.

SUMMARY Diversity in fruit morphology is one of the hallmarks of varietal differences among modern cultivars of fruit-bearing crops. As evolutionarily related organs, fruits and leaves share developmental processes, but there are surprisingly few connections between regulatory pathways for fruit and leaf development. Here, we show the regulation of the leaf development-associated TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF (TCP) TCP4/LANCEOLATE (TCP4/LA) transcription factor by the microRNA319 (miR319) is crucial for gynoecium patterning and establishment of fruit morphology. Loss of miR319 regulation leads to a premature, ectopic TCP4/LA expression during gynoecium patterning, which results in elongated fruits, resembling ovate mutants. TCP4/LA modulates tomato fruit development and morphology partially by directly repressing OVATE expression as early as 5-8 days post-inflorescence (dpi) flower buds. Furthermore, miR319-targeted CINCINNATA-like TCP4/LANCEOLATE controls auxin responses in developing flower buds by directly binding to the SlYUCCA4 promoter. Modulation of auxin biosynthesis by TCP4/LA is shared with other CINCINNATA-like TCPs during Arabidopsis gynoecium patterning. Our study defines a novel miRNA-based molecular link between OVATE , a fundamental gene associated with tomato domestication, and auxin responses in the control of fruit development and morphology. Given the striking variation in fruit shape among members of the Solanaceae family, fine-tuning regulation of gene expression by miRNA coupled with modulation of hormone dynamics may be a common driver in the evolution of fruit-shape diversity.

SUMMARY Fruit morphogenesis is determined by the coordination of cell division and expansion, which are fundamental processes required for the development of all plant organs. Here, we show that the regulation of TEOSINTE BRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF (TCP) LANCEOLATE ( TCP2/LA ) by miR319 is crucial for tomato fruit morphology. The loss of miR319 regulation in the semi‐dominant La mutant led to a premature SlTCP2/LA expression during gynoecium patterning, which results in modified cell division during carpel development. As a consequence, La mutants exhibited elongated ovary and fruit shape, and a reduced number of ovules and seeds. Elongated fruit shape in La may be partially due to the SlTCP2/LA ‐mediated repression of OVATE activity in young floral buds. Further analysis showed that the de‐repression of SlTCP2/LA decreases auxin responses in young floral buds by directly repressing SlYUCCA4 expression, but SlTCP2/LA also acts in parallel with ENTIRE ( E ) to orchestrate fruit morphology and seed production. Our study defines a novel miRNA‐based molecular link between the domestication‐associated OVATE gene and auxin responses. Given the striking variation in fruit morphology among members of the Solanaceae family, fine‐tuning regulation of gene expression by miRNA coupled with modulation of auxin dynamics may be a common driver in the evolution of fruit shape diversity.