ABSTRACT Following the Zika virus (ZIKV) outbreak in the Americas, ZIKV was causally associated with microcephaly and a range of neurological and developmental symptoms, termed congenital Zika syndrome (CZS). The isolates responsible for this outbreak belonged to the Asian lineage of ZIKV. However, in-vitro and in-vivo studies assessing the pathogenesis of African-lineage ZIKV demonstrated that African-lineage isolates often replicated to high titer and caused more severe pathology than Asian-lineage isolates. To date, the pathogenesis of African-lineage ZIKV in a translational model, particularly during pregnancy, has not been rigorously characterized. Here we infected four pregnant rhesus macaques with a low-passage strain of African-lineage ZIKV and compared its pathogenesis to a cohort of four pregnant rhesus macaques infected with an Asian-lineage isolate and a cohort of mock-infected controls. Viral replication kinetics were not significantly different between the two experimental groups and both groups developed robust neutralizing antibody titers above levels considered to be protective. There was no evidence of significant fetal head growth restriction or gross fetal harm at delivery in either group. However, a significantly higher burden of ZIKV vRNA was found in maternal-fetal interface tissues in the macaques exposed to an African-lineage isolate. Our findings suggest that ZIKV isolates of any genetic lineage pose a threat to women and their infants. IMPORTANCE ZIKV was first identified over 70 years ago in Africa, but most of our knowledge of ZIKV is based on studies of the distinct Asian genetic lineage, which caused the outbreak in the Americas in 2015-16. In its most recent update, the WHO stated that improved understanding of African-lineage pathogenesis during pregnancy must be a priority. Recent detection of African-lineage isolates in Brazil underscores the need to understand the impact of these viruses. Here we provide the first comprehensive assessment of African-lineage ZIKV infection during pregnancy in a translational non-human primate model. We show African-lineage isolates replicate with similar kinetics to Asian-lineage isolates and are capable of infecting the placenta. However, there was no evidence of more severe outcomes with African-lineage isolates. Our results highlight both the threat that African-lineage ZIKV poses to women and their infants and the need for future epidemiological and translational in-vivo studies with African-lineage ZIKV.

Countermeasures against Zika virus (ZIKV), including vaccines, are frequently tested in nonhuman primates (NHP). Macaque models are important for understanding how ZIKV infections impact human pregnancy due to similarities in placental development. The lack of consistent adverse pregnancy outcomes in ZIKV-affected pregnancies poses a challenge in macaque studies where group sizes are often small (4-8 animals). Studies in small animal models suggest that African-lineage Zika viruses can cause more frequent and severe fetal outcomes. No adverse outcomes were observed in macaques inoculated with a low dose of African-lineage ZIKV at gestational day (GD) 45. Here, we inoculate eight pregnant rhesus macaques with a higher dose of African-lineage ZIKV at GD 45 to test the hypothesis that adverse pregnancy outcomes are dose-dependent. Three of eight pregnancies ended prematurely with fetal death. ZIKV was detected in both fetal and placental tissues from all cases of early fetal loss. Further refinements of this challenge system (e.g., varying the dose and timing of infection) could lead to an even more consistent, unambiguous fetal loss phenotype for assessing ZIKV countermeasures in pregnancy. These data demonstrate that high-dose inoculation with African-lineage ZIKV causes pregnancy loss in macaques and also suggest that ZIKV-induced first trimester pregnancy could be strain-specific.

Abstract In the 2016 Zika virus (ZIKV) pandemic, a previously unrecognized risk of birth defects surfaced in babies whose mothers were infected with Asian-lineage ZIKV during pregnancy. Less is known about the impacts of gestational African-lineage ZIKV infections. Given high human immunodeficiency virus (HIV) burdens in regions where African-lineage ZIKV circulates, we evaluated whether pregnant rhesus macaques infected with simian immunodeficiency virus (SIV) have a higher risk of African-lineage ZIKV-associated birth defects. Remarkably, in both SIV+ and SIV-animals, ZIKV infection early in the first trimester caused a high incidence (78%) of spontaneous pregnancy loss within 20 days. These findings suggest a significant risk for early pregnancy loss associated with African-lineage ZIKV infection and provide the first consistent ZIKV-associated phenotype in macaques for testing medical countermeasures.

Interactions between microbiota and enteric pathogens can promote colonization resistance or enhance pathogenesis. The pathobiont Enterococcus faecalis increases enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) virulence by upregulating Type 3 Secretion System (T3SS) expression, effector translocation, and attaching and effacing (AE) lesion formation on enterocytes, but the mechanisms underlying this remain unknown. Using co-infection of organoids, metabolomics, supplementation experiments and bacterial genetics, here we show that co-culture of EHEC with E. faecalis increases the xanthine-hypoxanthine pathway activity and adenine biosynthesis. Adenine or E. faecalis promoted T3SS gene expression, while transcriptomics showed upregulation of adeP expression, which encodes an adenine importer. Mechanistically, adenine relieved High hemolysin activity (Hha)-dependent repression of T3SS gene expression in EHEC and promoted AE lesion formation in an AdeP-dependent manner. Microbiota-derived purines, such as adenine, support multiple beneficial host responses; however, our data show that this metabolite also increases EHEC virulence, highlighting the complexity of pathogen-microbiota-host interactions in the gut.

Abstract Background Congenital Zika virus (ZIKV) infection can result in birth defects, including malformations in the fetal brain and visual system. There are two distinct genetic lineages of ZIKV: African and Asian. Asian lineage ZIKVs have been associated with adverse pregnancy outcomes in humans; however, recent evidence from experimental models suggests that African-lineage viruses can also be vertically transmitted and cause fetal harm. Methodology/Principal Findings To evaluate the potential for vertical transmission of African-lineage ZIKV, we inoculated nine pregnant rhesus macaques ( Macaca mulatta ) subcutaneously with 44 plaque- forming units of a ZIKV strain from Senegal, (ZIKV-DAK). Dams were inoculated either at gestational day 30 or 45. Following maternal inoculation, pregnancies were surgically terminated seven or 14 days later and fetal and maternal-fetal interface tissues were collected and evaluated. Infection in the dams was evaluated via plasma viremia and neutralizing antibody titers pre- and post- ZIKV inoculation. All dams became productively infected and developed strong neutralizing antibody responses. ZIKV RNA was detected in maternal-fetal interface tissues (placenta, decidua, and fetal membranes) by RT-qPCR and in situ hybridization. In situ hybridization detected ZIKV predominantly in the decidua and revealed that the fetal membranes may play a role in ZIKV vertical transmission. Infectious ZIKV was detected in the amniotic fluid of three pregnancies and one fetus had ZIKV RNA detected in multiple tissues. No significant pathology was observed in any fetus; however, we did find an increase in the occurrence of decidual vasculitis and necrosis in ZIKV-exposed pregnancies compared to gestational-age-matched controls. Conclusions/Significance This study demonstrates that African-lineage ZIKV, like Asian-lineage ZIKV, can be vertically transmitted to the macaque fetus during pregnancy. The low inoculating dose used in this study suggests a low minimal infectious dose for rhesus macaques. Vertical transmission with a low dose in macaques further supports the high epidemic potential of African ZIKV strains. Author Summary Zika virus infection during pregnancy can result in adverse pregnancy outcomes including birth defects and miscarriage. There are two distinct genetic backgrounds of Zika virus: Asian-lineage and African-lineage. Currently, only Asian-lineage Zika virus is causally associated with adverse pregnancy outcomes in people. However, experimental studies have shown that African-lineage Zika virus can infect the fetus during pregnancy and cause adverse outcomes. Adverse pregnancy outcomes may not be associated with infection in people until there is an outbreak in a naive population. Thus, as African-lineage Zika virus continues to spread globally, the risk that it may pose to pregnant people remains a public health concern. In this study, we demonstrate that African-lineage Zika virus can be transmitted from the mother to the fetus during pregnancy. This study is significant because we used rhesus macaques, an animal that shares many key elements of Zika virus infection in pregnant people. This study is also significant because we inoculated pregnant macaques with a very small amount of virus, suggesting that fetal infection reported in previously published macaque studies is not limited to high-dose inoculation.

Abstract Congenital Zika virus (ZIKV) infection impacts fetal development and pregnancy outcomes. We infected a pregnant rhesus macaque with a Puerto Rican ZIKV isolate in the first trimester. The pregnancy was complicated by preterm premature rupture of membranes (PPROM) and fetal demise 49 days post infection (gestational day 95). Significant pathology at the maternal-fetal interface included acute chorioamnionitis, placental infarcts, and leukocytoclastic vasculitis of the myometrial radial arteries. ZIKV RNA was disseminated throughout the fetus tissues and maternal immune system at necropsy, as assessed by quantitative RT-PCR for viral RNA. Replicating ZIKV was identified in fetal tissues, maternal lymph node, and maternal spleen by fluorescent in situ hybridization for viral replication intermediates. Fetal ocular pathology included a choroidal coloboma, suspected anterior segment dysgenesis, and a dysplastic retina. This is the first report of ocular pathology and prolonged viral replication in both maternal and fetal tissues following congenital ZIKV infection in rhesus macaques. PPROM followed by fetal demise and severe pathology of the visual system have not been described in macaque congenital infection previously; further nonhuman primate studies are needed to determine if an increased risk for PPROM is associated with congenital Zika virus infection. Author summary A ZIKV infection during pregnancy is associated with malformations in fetal development including, but not limited to, ocular and brain anomalies, such as microcephaly, and stillbirth. The development of an accurate pregnancy model to study the effects of ZIKV will provide insight into vertical transmission, ZIKV tissue distribution, and fetal injury and malformations. Non-human primates closely resemble human in terms of the reproductive system, immunity, placentation and pregnancy. Our study demonstrates that the rhesus macaque is a compelling model in which to study ZIKV during pregnancy due to similar outcomes between the human and rhesus macaque. These similarities include prolonged viremia, vertical transmission, adverse pregnancy outcomes and fetal pathology, including defects in the visual system.

One third of infants who have prenatal Zika virus (ZIKV) exposure and lack significant defects consistent with congenital Zika syndrome (CZS) manifest neurodevelopmental deficits in their second year of life. We hypothesized that prenatal ZIKV exposure would lead to brain abnormalities and neurodevelopmental delays in infant macaques, as measured by quantitative hearing, neurodevelopmental, ocular and brain imaging studies. We inoculated 5 pregnant rhesus macaques with ZIKV during the first trimester, monitored pregnancies with serial ultrasounds, determined plasma viral RNA (vRNA) loads, and evaluated the infants for birth defects and neurodevelopmental deficits during their first week of life. ZIKV-exposed and control infants (n=16) were evaluated with neurobehavioral assessments, ophthalmic examinations, optical coherence tomography, electroretinography with visual evoked potentials, hearing examinations, magnetic resonance imaging (MRI) of the brain, gross post mortem examination, and histopathological and vRNA analyses of approximately 40 tissues and fluids. All 5 dams had ZIKV vRNA in plasma and seroconverted following ZIKV inoculation. One pregnancy resulted in a stillbirth. The ZIKV-exposed infants had decreased cumulative feeding volumes and weight gains compared with control infants, and also had grey matter abnormalities in the pharyngeal motor cortex identified by quantitative voxel-based morphometric comparisons. Quantitative ocular studies identified differences between ZIKV-exposed and control infants in retinal layer thicknesses and electroretinograms that were not identified in qualitative ophthalmic evaluations. Despite these findings of neuropathology, no ZIKV vRNA or IgM was detected in the infants. This suggests that ZIKV exposure without measurable vertical transmission can affect brain development in utero and that subtle neurodevelopmental delays may be detected with quantitative analyses in early infancy. Quantitative brain analyses, such as these, may predict neurodevelopmental delays that manifest later in childhood and allow early intervention and targeted therapies to improve functional outcomes of ZIKV exposed children.

Abstract From 2010 to 2015, 73 common marmosets ( Callithrix jacchus ) housed at the Wisconsin National Primate Research Center (WNPRC) were diagnosed postmortem with lymphocytic enterocolitis. We used unbiased deep-sequencing to screen the blood of deceased enterocolitis-positive marmosets for the presence of RNA viruses. In five out of eight marmosets with lymphocytic enterocolitis, we discovered a novel pegivirus that was not present in ten subsequently deep-sequenced matched, clinically-normal common marmosets with no evidence of lymphocytic enterocolitis. The novel virus, which we have named Southwest bike trail virus (SOBV), is most closely related (68% nucleotide identity) to a strain of simian pegivirus A that was previously isolated from a three-striped night monkey ( Aotus trivirgatus ). To determine the prevalence of this novel virus within the WNPRC marmoset colony, we screened 146 living animals and found an overall prevalence of 34% (50/146). Over the next four years, 85 of the 146 screened marmosets died or were euthanized and were examined histologically for lymphocytic enterocolitis. Out of these 85 animals, 27 SOBV-positive common marmosets had developed lymphocytic enterocolitis, compared to 42 SOBV-negative common marmosets, indicating no evidence of an association between this virus and development of enterocolitis in this cohort ( p =0.0798). The novel pegivirus was also found in two of 32 (6%) clinically-normal common marmosets screened while in quarantine during the transfer from the New England Primate Research Center to the WNPRC, suggesting SOBV has different prevalence at different centers and could exert confounding influences on the comparison of marmoset studies from multiple centers. Importance Common marmosets ( Callithrix jacchus ) are a valuable model species. We discovered two variants of a novel simian pegivirus, which we named the Southwest bike trail virus (SOBV), in common marmosets which had postmortem histologic diagnosis of lymphocytic enterocolitis. The virus was not present in ten matched, clinically-normal controls. We screened 146 live healthy common marmosets in the Wisconsin National Primate Research Center colony and found 34% (50/146) of the animals were SOBV-positive. SOBV was also present in two of 32 (6%) clinically-normal common marmosets from the New England Primate Research Center. These findings could have confounding effects in animal studies, especially those in which infection-free animals are desired, and they demonstrate the need for further investigations into SOBV transmission, the length of time of SOBV persistence, and SOBV prevalence at other primate centers, in order to increase understanding of the effects of SOBV and of this viral genus.

Defining the complex dynamics of Zika virus (ZIKV) infection in pregnancy and during transmission between vertebrate hosts and mosquito vectors is critical for a thorough understanding of viral transmission, pathogenesis, immune evasion, and potential reservoir establishment. Within-host viral diversity in ZIKV infection is low, which makes it difficult to evaluate infection dynamics. To overcome this biological hurdle, we constructed a molecularly barcoded ZIKV. This virus stock consists of a synthetic swarm whose members are genetically identical except for a run of eight consecutive degenerate codons, which creates approximately 64,000 theoretical nucleotide combinations that all encode the same amino acids. Deep sequencing this region of the ZIKV genome enables counting of individual barcode clonotypes to quantify the number and relative proportions of viral lineages present within a host. Here we used these molecularly barcoded ZIKV variants to study the dynamics of ZIKV infection in pregnant and non-pregnant macaques as well as during mosquito infection/transmission. The barcoded virus had no discernible fitness defects in vivo, and the proportions of individual barcoded virus templates remained stable throughout the duration of acute plasma viremia. ZIKV RNA also was detected in maternal plasma from a pregnant animal infected with barcoded virus for 64 days. The complexity of the virus population declined precipitously 8 days following infection of the dam, consistent with the timing of typical resolution of ZIKV in non-pregnant macaques, and remained low for the subsequent duration of viremia. Our approach showed that synthetic swarm viruses can be used to probe the composition of ZIKV populations over time in vivo to understand vertical transmission, persistent reservoirs, bottlenecks, and evolutionary dynamics.

Abstract Objectives The bacterium Listeria monocytogenes (Lm) is associated with adverse pregnancy outcomes. Infection occurs through consumption of contaminated food that is disseminated to the maternal-fetal interface. The influence on the gastrointestinal microbiome during Lm infection remains unexplored in pregnancy. The objective of this study was to determine the impact of listeriosis on the gut microbiota of pregnant macaques. Methods A nonhuman primate model of listeriosis in pregnancy has been previously described [1, 2]. Both pregnant and nonpregnant cynomolgus macaques were inoculated with L. monocytogenes and bacteremia and fecal shedding were monitored for 14 days. Nonpregnant animal tissues were collected at necropsy to determine bacterial burden, and fecal samples from both pregnant and nonpregnant animals were evaluated by 16S rRNA next-generation sequencing. Results Unlike pregnant macaques, nonpregnant macaques did not exhibit bacteremia, fecal shedding, or tissue colonization by Lm. Dispersion of Lm during pregnancy was associated with a significant decrease in alpha-diversity of the host gut microbiome, compared to nonpregnant counterparts. The combined effects of pregnancy and listeriosis were associated with a significant loss in microbial richness, although there were increases in some genera and decreases in others. Conclusions Although pregnancy alone is not associated with gut microbiome disruption, we observed dysbiosis with listeriosis during pregnancy. The macaque model may provide an understanding of the roles that pregnancy and the gut microbiota play in the ability of Lm to establish intestinal infection and disseminate throughout the host, thereby contributing to adverse pregnancy outcomes and risk to the developing fetus. Summary sentence Intestinal microbial composition in macaques is influenced by significant interaction between the pregnant state and exposure to Listeria monocytogenes , associated in particular with significant changes to Akkermansia, Eubacteria ruminantum, Methanobrevibacter, Prevotella, and Treponema .