Summary Whether synthetic genomes can power life has attracted broad interest in the synthetic biology field, especially when the synthetic genomes are extensively modified with thousands of designer features. Here we report de novo synthesis of the largest eukaryotic chromosome thus far, synIV , a 1,454,621-bp Saccharomyces cerevisiae chromosome resulting from extensive genome streamlining and modification. During the construction of synIV , we developed megachunk assembly combined with a hierarchical integration strategy, which significantly increased the accuracy and flexibility of synthetic chromosome construction and facilitated chromosome debugging. In addition to the drastic sequence changes made to synIV by rewriting it, we further manipulated the three-dimensional structure of synIV in the yeast nucleus to explore spatial gene regulation within the nuclear space. Surprisingly, we found few gene expression changes, suggesting that positioning inside the yeast nucleoplasm plays a minor role in gene regulation. Lastly, we tethered synIV to the inner nuclear membrane via its hundreds of loxPsym sites and observed transcriptional repression of the entire chromosome, demonstrating chromosome-wide transcription manipulation without changing the DNA sequences. Our manipulation of the spatial structure of the largest synthetic yeast chromosome shed light on higher-order architectural design of the synthetic genomes. Graphical abstract Highlights De novo synthesis of the largest eukaryotic chromosome, synIV SynIV shows similar 3D structure to wild-type IV, despite thousands of changes made to it “Inside-out” repositioning of synIV in nucleus shows minor transcriptional changes Multipoint tethering synIV to inner nuclear membrane represses transcription of whole chromosome

Upstream open reading frames (uORFs) are established as cis-acting elements for eukaryotic translation of annotated ORFs (anORFs) located on the same mRNAs. Here, we identified a mammalian uORF with functions that are independent from anORF translation regulation. Bioinformatics screening using ribosome profiling data of human and mouse brains yielded 308 neurologically vital genes from which anORF and uORFs are polycistronically translated in both species. Among them, Arhgef9 contains a uORF named SPICA, which is highly conserved among vertebrates and stably translated only in specific brain regions of mice. Disruption of SPICA translation by ATG-to-TAG substitutions did not perturb translation or function of its anORF product, collybistin. SPICA-null mice displayed abnormal maternal reproductive performance and enhanced anxiety-like behavior, characteristic of ARHGEF9-associated neurological disorders. This study demonstrates that mammalian uORFs can be independent genetic units, revising the prevailing dogma of the monocistronic gene in mammals, and even eukaryotes.

The principle of three-dimensional protein structure formation is a long-standing conundrum in structural biology. A globular domain of a soluble protein is formed by a network of atomic contacts among amino acid residues, but regions external to globular domains, like loop and linker, often do not have intramolecular contacts with globular domains. Although these regions can play key roles for protein function as interfaces for intermolecular interactions, their nature remains unclear. Here, we termed protein segments external to globular domains as floating segments and sought for them in tens of thousands of entries in the Protein Data Bank. As a result, we found that 0.72 % of residues are in floating segments. Regarding secondary structural elements, coil structures are enriched in floating segments, especially for long segments. Interactions with polypeptides and polynucleotides, but not small compounds, are enriched in floating segments. The amino acid preferences of floating segments are similar to those of surface residues, with exceptions; the small side chain amino acids, Gly and Ala, are preferred, and some charged side chains, Arg and His, are disfavored for floating segments compared to surface residues. Our comprehensive characterization of floating segments may provide insights into understanding protein sequence-structure-function relationships.

Abstract Functional annotation of the vast noncoding landscape of the diploid human genome still remains a major challenge of genomic research. An efficient, scarless, biallelic, and gene-wide mutagenesis approach is needed for direct investigation of the functional significance of endogenous long introns in gene regulation. Here we established a genome substitution platform, the Universal Knock-in System or UKiS, that meets these requirements. For proof of concept, we first used UKiS on the longest intron of TP53 in the pseudo-diploid cell line HCT116. Complete deletion of the intron, its substitution with mouse and zebrafish syntenic introns, and specific removal of retrotransposon-derived elements (retroelements) were all efficiently and accurately achieved in both alleles, revealing a suppressive role of intronic Alu elements in TP53 expression. We also used UKiS for TP53 intron deletion in human induced pluripotent stem cells without losing their stemness. Furthermore, UKiS enabled biallelic removal of all introns from three human gene loci of ∼100 kb and longer to demonstrate that intron requirements for transcriptional activities vary among genes. UKiS is a new standard platform with which to pursue the design of noncoding regions for genome writing in human cells.

ABSTRACT Missing an entire chromosome or chromosome arm in normal diploid cells has a deleterious impact on cell viability, which may contribute to the development of specific birth defects. Nevertheless, the effects of chromosome loss in human cells have remained unexplored due to the lack of suitable model systems. Here, we developed an efficient, selection‐free approach to generate partial monosomy in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). The introduction of Cas9 proteins and a pair of gRNAs induces over megabase‐sized interstitial chromosomal deletions. Using human chromosome 21 (HSA21) as a model, partial monosomy 21q (PM21q) iPSC lines with deletions ranging from 4.5 to 27.9 Mb were isolated. A 33.6 Mb deletion, encompassing all protein‐coding genes on 21q, was also achieved, establishing the first 21q monosomy human iPSC line. Transcriptome and proteome analyses revealed that the abundances of mRNA and protein encoded by the majority of genes in the monosomic regions are half of the diploid expression level, indicating an absence of dosage compensation. The ability to generate customized partial monosomy cell lines on an isogenic, karyotypically normal background should facilitate the gain of novel insights into the impact of chromosome loss on cellular fitness.