Summary Site-directed spin labeling of proteins via non-canonical amino acids (ncAAs) is a non-traditional method for the measurement of pseudocontact shifts (PCSs) by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. PCSs provide long-range distance and orientational information between a paramagnetic center and protein nuclei that can be used as restraints for computational structural modeling techniques. Here, we present the first experimental structure of an ncAA chemically linked to a lanthanide tag conjugated to the protein, T4-Lysozyme (T4L). T4L was crystallized with a cyclen-based C3 tag coordinated to the paramagnetic ion terbium (Tb 3+ ). The paramagnetic C3-lanthanide tag generated PCSs measured at four different ncAA sites. We show that the addition of these restraints improves structure prediction protocols for T4L using the RosettaNMR framework. Generated models provide insight into T4L conformational flexibility sampled in solution. This integrative modeling protocol is readily transferable to larger proteins. Methods to predict protein structures are advancing into an exciting arena such that reliable experimental data will play important roles for evaluating the biophysical relevance of predicted structural models. Our contribution here caters to the growing interest in using ncAAs for a range of biophysical studies, and these methods can be readily transferred to larger protein systems of interest.

Abstract A single experimental method alone often fails to provide the resolution, accuracy, and coverage needed to model integral membrane proteins (IMPs). Integrating computation with experimental data is a powerful approach to supplement missing structural information with atomic detail. We combine RosettaNMR with experimentally-derived paramagnetic NMR restraints to guide membrane protein structure prediction. We demonstrate this approach using the disulfide bond formation protein B (DsbB), an α-helical IMP. We attached a cyclen-based paramagnetic lanthanide tag to an engineered noncanonical amino acid (ncAA) using a copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) click chemistry reaction. Using this tagging strategy, we collected 203 backbone H N pseudocontact shifts (PCSs) for three different labeling sites and used these as input to guide de novo membrane protein structure prediction protocols in Rosetta. We find that this sparse PCS dataset combined with 44 long-range NOEs as restraints in our calculations improves structure prediction of DsbB by enhancements in model accuracy, sampling, and scoring. The most accurate DsbB models generated in this case gave Cα-RMSD values over the transmembrane region of 2.11 Å (best-RMSD) and 3.23 Å (best-scoring).

Abstract Fragment-based drug discovery begins with the identification of small molecules with a molecular weight of usually less than 250 Da that weakly bind to the protein of interest. This technique is challenging for computational docking methods as binding is determined by only a few specific interactions. Inaccuracies in the energy function or slight deviations in the docking pose can lead to the prediction of incorrect binding or difficulties in ranking fragments in in silico screening. Here we test RosettaLigand by docking a series of fragments to a cysteine-depleted variant of the TIM-barrel protein, HisF. We compare the computational results with experimental NMR spectroscopy screens. NMR spectroscopy gives details on binding affinities of individual ligands, which allows assessment of the ligand-ranking ability by RosettaLigand, and also provides feedback on the location of the binding pocket, which serves as a reliable test of RosettaLigand’s ability to identify plausible binding poses. From a library screen of 3456 fragments, we identified a set of 31 ligands with intrinsic affinities to HisF with dissociation constants as low as 400 µM. The same library of fragments was blindly screened in silico . RosettaLigand was able to rank binders before non-binders with an area under the curve (AUC) of the receiver operating characteristics (ROC) of 0.74. The docking poses observed for binders agreed with the binding pocket identified by NMR chemical shift perturbations for all fragments. Taken together, these results provide a baseline performance of RosettaLigand in a fragment-based drug discovery setting.

Measuring protein thermostability provides valuable information on the biophysical rules that govern structure-energy relationships of proteins. However, such measurements remain a challenge for membrane proteins. Here, we introduce a new experimental system to evaluate membrane protein thermostability. This system leverages a recently-developed non-fluorescent membrane scaffold protein (MSP) to reconstitute proteins into nanodiscs and is coupled with a nano-format of differential scanning fluorimetry (nanoDSF). This approach offers a label-free and direct measurement of the intrinsic tryptophan fluorescence of the membrane protein as it unfolds in solution without signal interference from the "dark" nanodisc. In this work, we demonstrate the application of this method using the disulfide bond formation protein B (DsbB) as a test membrane protein. NanoDSF measurements of DsbB reconstituted in dark nanodiscs show a complex biphasic thermal unfolding pattern in the presence of lipids with a minor unfolding transition followed by a major transition. The inflection points of the thermal denaturation curve reveal two distinct unfolding midpoint melting temperatures (Tm) of 70.5 °C and 77.5 °C, consistent with a three-state unfolding model. Further, we show that the catalytically conserved disulfide bond between residues C41 and C130 drives the intermediate state of the unfolding pathway for DsbB in a nanodisc. We introduce this method as a new tool that can be used to understand how compositionally, and biophysically complex lipid environments drive membrane protein stability.

ABSTRACT Parkinson disease (PD) is a progressive, neurodegenerative disorder affecting over 6.1 million people worldwide. Although the cause of PD remains unclear, studies of highly-penetrant mutations identified in early-onset familial parkinsonism have contributed to our understanding of the molecular mechanisms underlying disease pathology. Dopamine (DA) transporter (DAT) deficiency syndrome (DTDS) is a distinct type of infantile parkinsonism-dystonia that shares key clinical features with PD, including motor deficits (progressive bradykinesia, tremor, hypomimia) and altered DA neurotransmission. Here, we define structural, functional, and behavioral consequences of a Cys substitution at R445 in human DAT (hDAT R445C), identified in a patient with DTDS. We found that this R445 substitution disrupts a phylogenetically conserved intracellular (IC) network of interactions that compromise the hDAT IC gate. This is demonstrated by both Rosetta molecular modeling and fine-grained simulations using hDAT R445C, as well as EPR analysis and X-ray crystallography of the bacterial homolog leucine transporter. Notably, the disruption of this IC network of interactions supported a channel-like intermediate of hDAT and compromised hDAT function. We demonstrate that Drosophila melanogaster expressing hDAT R445C show impaired hDAT activity, which is associated with DA dysfunction in isolated brains and with abnormal behaviors monitored at high-speed time resolution. We show that hDAT R445C Drosophila exhibit motor deficits, lack of motor coordination (i.e. flight coordination) and phenotypic heterogeneity in these behaviors that is typically associated with DTDS and PD. These behaviors are linked with altered dopaminergic signaling stemming from loss of DA neurons and decreased DA availability. We rescued flight coordination through enhanced DAT surface expression via the lysosomal inhibitor chloroquine. Together, these studies shed light on how a DTDS-linked DAT mutation underlies DA dysfunction and, more broadly, the clinical phenotypes shared by DTDS and PD.

Abstract The epidermal growth factor (EGF) receptor (EGFR) is activated by the binding of one of seven EGF‐like ligands to its ectodomain. Ligand binding results in EGFR dimerization and stabilization of the active receptor conformation subsequently leading to activation of downstream signaling. Aberrant activation of EGFR contributes to cancer progression through EGFR overexpression/amplification, modulation of its positive and negative regulators, and/or activating mutations within EGFR. EGFR targeted therapeutic antibodies prevent dimerization and interaction with endogenous ligands by binding the ectodomain of EGFR. However, these antibodies have had limited success in the clinic, partially due to EGFR ectodomain resistance mutations, and are only applicable to a subset of patients with EGFR‐driven cancers. These limitations suggest that alternative EGFR targeted biologics need to be explored for EGFR‐driven cancer therapy. To this end, we analyze the EGFR interfaces of known inhibitory biologics with determined structures in the context of endogenous ligands, using the Rosetta macromolecular modeling software to highlight the most important interactions on a per‐residue basis. We use this analysis to identify the structural determinants of EGFR targeted biologics. We suggest that commonly observed binding motifs serve as the basis for rational design of new EGFR targeted biologics, such as peptides, antibodies, and nanobodies.